探討弓形蟲(chóng)感染孕鼠對(duì)胎盤激素調(diào)節(jié)功能的影響.pdf

1、目的：①采用不同劑量的弓形蟲(chóng)速殖子經(jīng)腹腔接種孕中期小鼠，建立弓形蟲(chóng)急性感染孕鼠的模型。②利用弓形蟲(chóng)感染孕鼠模型，測(cè)定胎盤分泌的生乳素(HPL)、乙酰膽堿(Ach)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的含量，觀察蟲(chóng)體是否影響這些激素的水平。⑧利用弓形蟲(chóng)感染孕鼠模型，測(cè)胎盤胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)的含量和11β-羥基類固醇脫氫酶-2(11β-HSD2)的表達(dá)，觀察蟲(chóng)體是否影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。④利用弓形蟲(chóng)感染孕鼠模型，測(cè)胎盤分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋

2、放激素(CRH)和一氧化氮合酶(eNOS和iNOS)的含量，觀察蟲(chóng)體是否影響胎盤血流。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的觀察，探討弓形蟲(chóng)感染宿主孕鼠，是否影響胎盤激素正常的調(diào)節(jié)功能，來(lái)系統(tǒng)地分析和揭示弓形蟲(chóng)感染妊娠期宿主影響胎盤內(nèi)分泌的作用機(jī)制。
　　 方法：1．建立弓形蟲(chóng)感染孕中期的小鼠模型：取約10周齡健康的BALB/C處女鼠，體重(20～22g)，與雄鼠2：1合籠，次晨查陰栓，查到陰栓記為妊娠第0天，并稱孕鼠體重。于妊娠第8天再稱孕鼠體重

3、，體重增重大于1.5g者納入實(shí)驗(yàn)鼠。將檢出的100只孕鼠，隨機(jī)分為5組（A-E組），每組20只。 A組為正常對(duì)照組， B、C、D、E組為染蟲(chóng)組，A組孕鼠經(jīng)腹腔注射0.2ml無(wú)菌PBS，B-E組孕鼠腹腔分別注射經(jīng)胰酶蛋白酶消化的弓形蟲(chóng)速殖子25、50、100、200個(gè)/0.2ml/只。①觀察各組孕鼠的健康狀態(tài)，有無(wú)豎毛、倦怠、弓背等異常表現(xiàn)，體重增加情況。②確認(rèn)孕鼠是否染蟲(chóng)于妊娠第12d、14d、16d、18d稱重、隨機(jī)、分批處死各組孕鼠

4、5只，抽取腹腔液中查找弓形蟲(chóng)速殖子。③各劑量組孕鼠處死，取胎鼠和胎盤，解剖鏡下觀察胎鼠的存活，有無(wú)吸收胎及死胎數(shù)，計(jì)算胎鼠的存活率。④稱胎盤的重量。通過(guò)以上指標(biāo)觀察各劑量蟲(chóng)體對(duì)孕鼠的毒性作用，建立弓形蟲(chóng)急性感染孕中期的小鼠模型。2．將檢出的孕鼠40只，隨機(jī)分為2組（正常對(duì)照組和染蟲(chóng)組），每組20只；孕鼠于妊娠第8天，正常對(duì)照組腹腔注射0.2ml無(wú)菌PBS，染蟲(chóng)組腹腔注射50個(gè)/0.2ml/只，于妊娠第12d、14d、16d、18d處死孕

5、鼠，收集母鼠血清，備用；將各組1/2的胎盤制成勻漿液，采用放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)檢測(cè)生乳素(HPL)的含量，堿性羥胺比色法測(cè)乙酰膽堿(Ach)的含量；剩余1/2胎盤固定、包埋、切片，用免疫組織化學(xué)法(immunohistochemistry)測(cè)胎盤組織表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的表達(dá)量。通過(guò)以上三個(gè)指標(biāo)分析和闡述蟲(chóng)體對(duì)胎盤激素致物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；3．用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)胎盤勻漿液中IGF-Ⅱ含

6、量，采用免疫組化法測(cè)胎盤組織內(nèi)11β-HSD2的表達(dá)量，分析弓形蟲(chóng)對(duì)胎盤激素致胎兒發(fā)育不良的影響；4．利用收集各組孕鼠的血清，用ELISA測(cè)母體血清中促腎上腺激素釋放激素(CRH)的含量，用免疫組化法測(cè)胎盤組織中eNOS和iNOS的表達(dá)，分析蟲(chóng)體對(duì)胎盤激素致胎盤血流的影響。
　　 結(jié)果：①正常對(duì)照A組孕鼠隨著妊娠天數(shù)的增加，孕鼠未見(jiàn)豎毛、倦怠、弓背等異常表現(xiàn)，體重增加明顯，胎鼠發(fā)育外觀正常，存活率高達(dá)97％;。染蟲(chóng)組孕鼠隨著妊娠

7、天數(shù)的延長(zhǎng)，孕鼠有不同程度呈現(xiàn)豎毛、倦怠、弓背、活動(dòng)量和采食量減少等異常表現(xiàn)；除了B組，染蟲(chóng)孕鼠體重均不同程度呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì)。B組和C組隨著妊娠天數(shù)的延長(zhǎng)，各個(gè)妊娠天數(shù)均有活胎存在，但其存活率低于A組；而D和E組在妊娠后期無(wú)存活胎鼠，說(shuō)明D、E劑量對(duì)胎鼠及胎盤的毒性作用較大，不宜作為建模的實(shí)驗(yàn)劑量；將B組和A組、C組和A組相同妊娠天數(shù)胎鼠存活率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：B組與A組僅在妊娠第18d，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；C組與A

8、組除了妊娠第12d，其余妊娠天數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)胎盤重量進(jìn)行均數(shù)比較，組內(nèi)不同妊娠天數(shù)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FA=53.731，F(xiàn)B=16.319，F(xiàn)c=7.621，F(xiàn)D=11.336，F(xiàn)E=3.367，P<0.05)；組間相同妊娠天數(shù)，B-E組胎盤重量均低于正常對(duì)照組，B組與A組比較，僅在妊娠第16d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組和A組比較，除了妊娠第12d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②弓形蟲(chóng)感

9、染孕中期小鼠，正常對(duì)照組胎盤組織中生乳素的含量隨妊娠天數(shù)的增加而增多，而染蟲(chóng)組則先升高后下降；乙酰膽堿和表皮生長(zhǎng)因子的含量隨著妊娠天數(shù)的增加而下降，但染蟲(chóng)組的含量下降較為明顯。兩組內(nèi)不同妊娠天數(shù)的比較，胎盤組織中生乳素和表皮生長(zhǎng)因子的含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HPL：F正常對(duì)照組組=3.260， F染蟲(chóng)組=5.573；EGF：F正常對(duì)照組=6.343，F(xiàn)染蟲(chóng)組=23.366，P<0.05）；正常A組乙酰膽堿含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F正常對(duì)照組

10、=3.091，P=0.57），染蟲(chóng)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F蟲(chóng)染組=20.933，P=0.00)；兩組間均數(shù)比較，生乳素和乙酰膽堿含量在妊娠第16天和第18天的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量在妊娠第14天、16天、18天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③IGF-Ⅱ檢測(cè)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組胎盤組織隨著妊娠天數(shù)的延長(zhǎng)，其含量基本呈逐漸上升的趨勢(shì)，但是染蟲(chóng)組則先降低后升高，波動(dòng)更加明顯。兩組內(nèi)不同妊娠天數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)

11、學(xué)意義（F正常對(duì)照組=11.763，F(xiàn)染蟲(chóng)組=39.137，P<0.05）；兩組間相同妊娠天數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。11β-HSD2檢測(cè)結(jié)果顯示：正常對(duì)照組的表達(dá)呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，但是感染組升高的趨勢(shì)不及正常對(duì)照組明顯，不同妊娠天數(shù)比較，正常對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F正常對(duì)照組=4.319，P=0.021)，而染蟲(chóng)組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F染蟲(chóng)組=0.313，P=0.816）；相同天數(shù)比較，除了第12天外，其余天數(shù)

12、差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t12d=2.066，P=0.242；t14d=3.264，P=O.0011；t16d=2.625，P=0.030; t18d=3.274，P=0.011)。④免疫組化定位顯示，eNOS主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，iNOS表達(dá)在胎盤巨噬細(xì)胞中。在正常對(duì)照組：eNOS的表達(dá)水平無(wú)明顯變化，而iNOS的表達(dá)水平極低；兩者表達(dá)水平染蟲(chóng)組均高于正常對(duì)照組。經(jīng)兩組不同妊娠天數(shù)比較，正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

13、eNOS:F正常對(duì)照組=2.390，P=0.107; iNOS：F正常對(duì)照組=0.816，P=0.504），染蟲(chóng)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（eNOS：F染蟲(chóng)組=11.398，P<0.05; iNOS:F染蟲(chóng)組=610.230，P=0.000）；相同妊娠天數(shù)比較，eNOS的表達(dá)量分別于妊娠第16d和18d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而iNOS表達(dá)量于12d、14d、16d、18d均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ELASE測(cè)定血清中CRH的含

14、量，正常對(duì)照組于妊娠16天濃度開(kāi)始升高(0.60±0.18) ng/ml;染蟲(chóng)組于妊娠14d明顯升高(0.16±0.89) ng/ml，16d達(dá)高峰(6.30±1.24) ng/ml，而妊娠18天下降為初始水平。兩組不同妊娠天數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F正常對(duì)照組=31.48，F(xiàn)染蟲(chóng)組=20.154，P<0.05）；兩組間相同妊娠天數(shù)比較，除第12d，其余各妊娠天數(shù)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/2d-0.763，P=0.467；t14d=2

15、.56，P=0.018；t16d=9.580，P=0.000；t18d=3.878，P<0.05)。
　　 結(jié)論：①采用50個(gè)弓形蟲(chóng)速殖子腹腔接種，其生殖毒性反應(yīng)小，胎鼠存活率高，是弓形蟲(chóng)感染孕中期小鼠的適宜劑量。②弓形蟲(chóng)感染孕中期小鼠，引起胎盤組織中HPL、Ach和EGF含量水平降低，說(shuō)明胎盤對(duì)葡萄糖、氨基酸等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)減弱，影響了胎兒營(yíng)養(yǎng)供給不足，可能導(dǎo)致胎兒發(fā)育不良。⑧弓形蟲(chóng)感染孕中期小鼠，造成胎盤IGF-Ⅱ含量及11β-