白細胞介素6人臍帶來源間充質(zhì)干細胞中的表達調(diào)控.pdf

1、目的:間充質(zhì)干細胞(MSC)是一類中胚層來源的多能干細胞,具有多向分化、造血支持及促進干細胞植入等功能。隨著對其認識的不斷深入,其免疫調(diào)節(jié)特性也越來越多地引發(fā)了研究者的關(guān)注[1,2];近來,MSC更是被作為免疫損傷性疾病的理想治療策略而被廣泛研究[26,27,28,29]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)體外預處理的人胎兒來源MSC可有效保護伴刀豆蛋白A(concanavalin A,ConA)誘導的小鼠免疫性肝損傷病情進展,其作用機制可能與白細

2、胞介素6(interleukin-6,IL-6)表達增高有關(guān)。經(jīng)檢索文獻,未見相關(guān)報道。本研究擬采用多種策略,調(diào)控IL-6在MSC中的表達,為進一步確證其是否是MSC保護免疫性肝損傷中的關(guān)鍵分子奠定基礎。
　　 方法:采用膠原酶消化貼壁傳代法,自人胎兒臍帶Wharton層獲取細胞,經(jīng)三代以上穩(wěn)定傳代后,行形態(tài)學觀察、流式細胞術(shù)分析細胞表面標記分子及定向誘導分化予以鑒定。通過慢病毒IL-6高/低表達載體轉(zhuǎn)染、腫瘤壞死因子α(tum

3、or necrosis factor,TNF-α)和干擾素γ(interferon,IFN-γ)單獨或聯(lián)合應用等策略,上調(diào)/下調(diào)IL-6在MSC中的表達,PT-PCR、real-time PCR鑒定基因表達。
　　 結(jié)果:
　　 1臍帶來源MSC的分離鑒定
　　 1.1原代細胞可在5至14天形成細胞集落,細胞最初表現(xiàn)為兩種形態(tài),多部分為成纖維細胞樣,一小部分為內(nèi)皮細胞樣,后者在傳代中將逐步消失,至第4代以后,呈現(xiàn)

4、典型的梭形生長形態(tài)。
　　 1.2流式細胞檢測結(jié)果顯示,間質(zhì)細胞標志CD29、CD90及CD105陽性表達;HLA-DR及造血細胞標志CD34陰性表達。
　　 1.3脂肪樣細胞定向誘導分化后,分離獲取的細胞胞質(zhì)中可出現(xiàn)大小不一的脂滴,油紅染色后呈現(xiàn)紅色;成骨樣細胞定向誘導分化后,細胞可逐漸變方,Von Kossa染色結(jié)果顯示,胞漿內(nèi)有棕黑色區(qū)域。提示該細胞具有脂肪樣和成骨樣細胞分化潛能。
　　 上述結(jié)果提示,我們

5、從臍帶獲取的細胞具有MSC典型特征,可用于下一步研究。
　　 2慢病毒IL-6表達載體的構(gòu)建
　　 2.1以質(zhì)粒pLXSN/IL-6為模板,PCR擴增IL-6片段,與T載體相連接,轉(zhuǎn)化擴增后,測序鑒定,結(jié)果顯示序列正確。提示IL-6基因與T載體連接成功。
　　 2.2 IL-6基因與慢病毒pBPLV載體相連接,轉(zhuǎn)化擴增后,測序鑒定,結(jié)果顯示序列正確。提示慢病毒IL-6表達載體(pBPLV/IL-6)構(gòu)建成功。

6、r>　　 3慢病毒IL-6表達載體轉(zhuǎn)染MSC
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,慢病毒IL-6表達載體(pBPLV/IL-6-MSC)的IL-6表達水平較慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的MSC及未轉(zhuǎn)染MSC(pBPLV-MSC;MSC)顯著增高(p＜0.05);
　　 real-time PCR結(jié)果亦顯示,pBPLV/IL-6-MSC組IL-6表達水平顯著高于pBPLV/MSC組和MSC組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,p

7、BPLV/IL-6轉(zhuǎn)染可顯著上調(diào)IL-6基因表達。
　　 4慢病毒IL-6干涉載體轉(zhuǎn)染MSC
　　 RT-PCR結(jié)果顯示,慢病毒IL-6干涉載體(pSicoR/IL-6-MSC)的IL-6表達水平較慢病毒空載體轉(zhuǎn)染的MSC及未轉(zhuǎn)染MSC(pSicoR-MSC;MSC)顯著降低(p＜0.05);
　　 real-time PCR結(jié)果亦顯示,pSicoR/IL-6-MSC組IL-6表達水平顯著低于pSicoR-MSC

8、組和MSC組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,pSicoR/IL-6轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)IL-6表達。
　　 5 ConA刺激的小鼠脾細胞培養(yǎng)上清對MSC IL-6表達的影響
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果均顯示不同濃度小鼠脾細胞培養(yǎng)上清處理后UCMSC IL-6表達水平均高于對照組(p＜0.05);
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果均顯示同一濃度小鼠脾細胞培養(yǎng)上清處

9、理后UCMSC于不同時間點IL-6表達水平均高于對照組(p＜0.05);
　　 上述結(jié)果提示,ConA刺激的小鼠脾細胞培養(yǎng)上清可顯著上調(diào)IL-6表達。
　　 6細胞因子TNF-α和IFN-γ聯(lián)合以及單獨應用對MSC IL-6表達的影響RT-PCR結(jié)果顯示不同濃度TNF-α和IFN-γ聯(lián)合應用其IL-6表達量顯著高于對照組(p＜0.05);
　　 RT-PCR、real-time PCR結(jié)果顯示同一濃度TNF-α和

10、IFN-γ聯(lián)合以及TNF-α單獨應用后UCMSC各時間點IL-6表達水平均高于對照組(p＜0.05),而IFN-γ單獨應用后各時間點IL-6表達水平均低于對照組(p＜0.05)。
　　 上述結(jié)果提示,TNF-α和IFN-γ聯(lián)合應用以及TNF-α單獨應用可上調(diào)IL-6表達,而IFN-γ單獨應用則下調(diào)IL-6表達。
　　 結(jié)論:
　　 1采用膠原酶消化貼壁傳代法,可自人胎兒臍帶Wharton層成功獲取合格的MSCC；