人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的優(yōu)化初探.pdf

1、目的：通過對(duì)混合酶組分、培養(yǎng)基的選擇、接種密度、首次換液時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，探討優(yōu)選人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）體外培養(yǎng)純化的最佳方法，為臍帶MSCs的制備和在臨床的廣泛應(yīng)用奠定研究基礎(chǔ)。
　　 方 法:
　　 1不同混合酶組分分離培養(yǎng)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞
　　 無菌條件下取正常足月剖腹產(chǎn)的臍帶近胎兒段；臍帶組織均分為9等分，每一等分臍帶長(zhǎng)度為0.5cm，仔細(xì)剔除動(dòng)靜脈，剪碎組織呈1mm×1mm×1mm大

2、??；按不同混合酶濃度比值劃分為混合酶Ⅰ組，混合酶Ⅱ組和混合酶Ⅲ組，每組再按消化時(shí)間分為1、2、3h三個(gè)亞組；重懸細(xì)胞終體積均定位4ml并計(jì)數(shù)，每個(gè)亞組計(jì)數(shù)6次，采用含血清的DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)細(xì)胞。觀察、計(jì)數(shù)并比較相同時(shí)間消化時(shí)間內(nèi)細(xì)胞總數(shù)，活細(xì)胞比值以及對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。
　　 2不同培養(yǎng)基、接種密度和首次換液時(shí)間培養(yǎng)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞
　　 將獲得的單個(gè)核細(xì)胞分別以5×105、1×106、5×106、1×1

3、07密度接種于六孔板中，觀察細(xì)胞貼壁延伸時(shí)間、原代培養(yǎng)時(shí)間；分別以間充質(zhì)專用培養(yǎng)基（MesencultTM）,L—DMEM、DMEM/F12均含有10％胎牛血清，對(duì)分離得到的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)狀況。
　　 3人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定和定向誘導(dǎo)
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞CD34、CD44、CD45、CD29、CD105的表達(dá)情況。Vonkassa方法和油紅O染色分別檢測(cè)人臍帶來源間充質(zhì)干

4、細(xì)胞成骨、成脂的誘導(dǎo)。
　　 結(jié) 果：1不同混合酶組分分離培養(yǎng)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞：采用三種不同混合酶濃度進(jìn)行消化，發(fā)現(xiàn)相同消化時(shí)間內(nèi)，混合酶Ⅲ組消化細(xì)胞最多，細(xì)胞總數(shù)與其他組比較，具有顯著性差異（P＜0.05）。在作用時(shí)間為3h時(shí)，混合酶Ⅲ組獲取的細(xì)胞中活細(xì)胞比值顯著低于混合酶Ⅰ組和混合酶Ⅱ組獲取細(xì)胞的活細(xì)胞比值，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。2 比較4種接種密度，觀察比較發(fā)現(xiàn)以5×105個(gè)/cm2密度接種細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)緩慢

5、，一直無法傳代，以5×106個(gè)/cm2密度接種細(xì)胞在出現(xiàn)延伸時(shí)間（92.0±6.3h）及原代培養(yǎng)時(shí)間（21.2±4.1d）方面均短于其余接種密度，差異具有顯著性意義。 3不同培養(yǎng)基對(duì)人臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響：18份標(biāo)本中其中用間充質(zhì)專用培養(yǎng)基培養(yǎng)的有14份（77.8％）得到均一的間充質(zhì)干細(xì)胞。其余4份得到的異質(zhì)性貼壁細(xì)胞多，細(xì)胞不均一，形態(tài)多樣。采用DMEM/F12培養(yǎng)的18份標(biāo)本中，有11份（61.1％）得到均一的間充質(zhì)干

6、細(xì)胞，6份得到異質(zhì)性貼壁細(xì)胞，1份細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，未貼壁。用L-DMEM培養(yǎng)基的18份標(biāo)本中，有9份（50.0％）最終得到均一的間充質(zhì)干細(xì)胞，但生長(zhǎng)速度緩慢，7份得到異質(zhì)性貼壁細(xì)胞，2份細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，未貼壁。 4 流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志鑒定CD31、CD34、CD45呈陰性，CD44、CD29、CD105呈陽(yáng)性，符合臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)特性。 5 臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)后可表達(dá)骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞特征。
　　 結(jié)