微粒體前列腺素E合酶1調(diào)控EP2受體促進肝癌細胞惡性生物學(xué)行為的實驗研究.pdf

1、目的:構(gòu)建并鑒定微粒體前列腺E合酶1(mPGES1)過表達慢病毒載體;觀察mPGES1基因過表達后對肝癌細胞Huh-7體外增殖、遷移侵襲以及體內(nèi)成瘤能力的影響;檢測過表達或下調(diào)mPGES1對肝癌細胞中前列腺素E2(PGE2)及其受體EP1、EP2、EP3和EP4表達水平的影響。探討mPGES1調(diào)控PGE2及其受體的信號途徑促進肝癌細胞增殖、遷移侵襲的可能機制。
　　方法:
　　(1)通過PCR特異性擴增目的基因mPGES1全

2、長。純化、酶切后與GV287載體連接得到目的基因重組質(zhì)粒,與慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,包裝生產(chǎn)mPGES1過表達慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP)。低溫超速濃縮病毒液并檢測病毒滴度。
　　(2)使用構(gòu)建的pGC-LV-mPGES1-GFP感染Huh-7細胞(過表達組),并設(shè)pGC-LV-NC-GFP(空載體組)組和未感染組。采用PCR、Westernblot等方法鑒定mPGES1基因過表達后的mRNA、蛋

3、白表達水平。采用MTT方法、基質(zhì)黏附實驗、Transwell遷移及侵襲實驗及流式細胞技術(shù)檢測mPGES1基因過表達前后Huh-7細胞的增殖、黏附、遷移和侵襲以及細胞周期的變化;將三組細胞分別接種于裸鼠皮下,觀察各組裸鼠移植瘤生長情況;第21d取瘤,肉眼和鏡下觀察移植瘤形態(tài)差別。
　　(3)用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa法)檢測過表達或下調(diào)mPGES1后肝癌細胞Huh-7或HepG2中PGE2表達水平變化,real-timePCR和

4、Westernblot檢測過表達或下調(diào)mPGES1后肝癌細胞Huh-7或HepG2中PGE2受體EP1、EP2、EP3和EP4表達水平變化。
　　結(jié)果:
　　(1)成功構(gòu)建過表達mPGES1的慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP),測定病毒生物學(xué)滴度為2×108TU/mL。
　　(2)與空載體組、未感染組相比,過表達組的mPGES1mRNA和蛋白表達明顯升高。
　　(3)與空載體組、未感染組相比,過表達

5、mPGES1的Huh-7細胞體外增殖、黏附、侵襲和遷移能力均不同程度升高。
　　(4)流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示過表達mPGES1的Huh-7細胞處于S期的比例高于空載體組和未感染組。
　　(5)裸鼠移植瘤模型建立過程中,過表達組移植瘤生長速度較其他兩組快;接種后21d收獲移植瘤,過表達組移植瘤體積及重量均大于其他兩組。
　　(6)與空載體組、未感染組相比,過表達mPGES1后Huh-7細胞中PGE2表達水平明顯升高;PG

6、E2的EP2表達水平明顯升高,EP1、EP3和EP4表達三組中無明顯差異。
　　(7)與LV-mPGES1-NC組、control組相比,LV-mPGES1-shRNA下調(diào)mPGES1后HepG2細胞中PGE2表達水平明顯下降;PGE2的EP2表達水平明顯下降,EP1、EP3和EP4表達三組中無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建過表達mPGES1的慢病毒載體(pGC-LV-mPGES1-GFP),高效轉(zhuǎn)染Huh-