GSK-3β,β-catenin和snail在高糖環(huán)境足細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用機(jī)制.pdf

1、背景：
　　 糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，而且現(xiàn)在已經(jīng)成為導(dǎo)致終末腎臟病(end-stagerenaldisease，ESRD)首位病因，大量的DN患者每年需要花費(fèi)巨額的醫(yī)療費(fèi)用，給社會和家庭帶來了極大的負(fù)擔(dān)。因而對糖尿病腎病(DN)的早期治療、早期干預(yù)有著十分重要的意義。在DN中足細(xì)胞的損傷對蛋白尿的發(fā)生和發(fā)展有很大的關(guān)系，而蛋白尿會造成DN的加重，最終發(fā)展成為ESR

2、D。因而越來越多學(xué)者將DN認(rèn)為是一種“足細(xì)胞病”。一些文獻(xiàn)和我們前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了，高糖刺激下會導(dǎo)致足細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(EMT)。
　　 糖原合成酶激酶3β(glycogensynthasekinase3β，GSK-3β)是細(xì)胞轉(zhuǎn)分化信號通路重要的調(diào)控因子，在通路中起著承上啟下的重要作用，影響了上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程。β-catenin、snail作為轉(zhuǎn)分化通路Wnt通路中關(guān)鍵的信號分子，通過影響下游靶基因的

3、表達(dá)，參與了細(xì)胞的增殖、分化、凋亡過程，影響了細(xì)胞的生物學(xué)特性。在高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中，β-catenin和snail是否參與其中，GSK-3β和β-catenin、snail的關(guān)系，目前尚未見文獻(xiàn)報道。
　　 目的：
　　 通過影響足細(xì)胞中GSK-3β表達(dá)后，觀察β-catenin、snail表達(dá)量的改變，以及β-catenin、snail和GSK-3β的相互關(guān)系，旨在探討β-catenin和snail是否參

4、與了高糖環(huán)境下足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程，以及在高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中，GSK-3β和β-catenin和snail的關(guān)系。以求為DN的發(fā)病機(jī)制及治療的新的方法提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 以條件永生系小鼠足細(xì)胞(MPC-5)為研究對象
　　 1.按不同的葡萄糖濃度分組:正常組(LG):葡萄糖5.6mmol/L;高糖刺激組(HG):葡萄糖濃度分別為12.5mmol/L(12.5HG)、25mmol/L(25

5、HG)、50mmol/L(50HG);高滲對照組(LG+M):葡萄糖5.6mmol/L+D-甘露醇19.4mmol/L。采用RT-PCR和GSK-3β激酶活性試劑盒，檢測GSK-3βmRNA表達(dá)量和其激酶活性的變化，采用RT-PCR和westernblot分別從蛋白和mRNA水平檢測通路蛋白β-catenin、snail、VDR(維生素D受體)的表達(dá)量的變化。
　　 2.干擾或抑制GSK-3β表達(dá)后，采用RT-PCR和weste

6、rnblot分別從蛋白和mRNA水平檢測通路蛋白β-catenin、snail的表達(dá)量的變化。
　　 3.按不同葡萄糖濃度分組:正常組(LG):葡萄糖5.6mmol/L;高糖刺激組(HG):葡萄糖25mmol/L。用免疫熒光方法檢測GSK-3β和β-catenin，β-catenin和VDR的表達(dá)量和細(xì)胞定位的改變，并用免疫熒光共定位法檢測其相互關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.RT-PCR和GSK-3β激酶活性試

7、劑盒結(jié)果顯示:隨著糖濃度的升高，足細(xì)胞GSK-3β的mRNA的表達(dá)量逐漸增多，且足細(xì)胞GSK-3β激酶活性逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示:發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的升高，β-catenin、snail的mRNA及蛋白的表達(dá)量逐漸升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示:下調(diào)GSK-3β表達(dá)后，β-catenin、sna

8、il的mRNA及蛋白的表達(dá)量較高糖組降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 3.免疫熒光結(jié)果顯示:高糖環(huán)境下GSK-3β和β-catenin的表達(dá)量較正常組增多，且在高糖影響下β-catenin發(fā)生了向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，免疫熒光共定位發(fā)現(xiàn)，高糖影響下GSK-3β和β-catenin較正常組沒有完全重疊，推測在高糖影響下的足細(xì)胞中β-catenin可能并不是僅通過GSK-3β調(diào)控其表達(dá)。
　　 4.免疫熒光結(jié)果顯示

9、:β-catenin和VDR(維生素D受體)在高糖和正常組免疫熒光共定位均存在細(xì)胞內(nèi)定位的重疊。RT-PCR和westernblot結(jié)果顯示:發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的升高，VDR的mRNA及蛋白的表達(dá)量逐漸降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。推測VDR可能參與了高糖影響下的足細(xì)胞中對β-catenin的調(diào)控影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.GSK-3β、轉(zhuǎn)分化信號分子β-catenin和snail參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞向間充