GSK-3β在人腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的: 研究糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)在轉(zhuǎn)化生長因子β<,1>(transforming growth factorβ<,1>，TGFβ<,1>)誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞株(human kidneyproximal tubular epithelial cell line，HKCs)發(fā)生腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial tomesenchymal tran

2、sition，EMT)過程中的表達(dá)及意義，以及磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)抑制劑Wortmannin的干預(yù)結(jié)果。 方法: 用含10％胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液將HKCs細(xì)胞接種于24孔板或培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞長到約60％～70％融合時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，換成無血清培養(yǎng)基(serum-free medium，F(xiàn)SM)同步

3、化24小時(shí)，然后分組如下：①正常對照組(C組)：FSM培養(yǎng)；②不同濃度TGFβ1(T<,A>)組：用含不同濃度TGFβ<,1>(T<,A1>組：5ng/ml，T<,A2>組：10ng/ml，T<,A3>組：20ng/ml)的FSM培養(yǎng)12h；③TGFβ<,1>刺激后不同時(shí)相點(diǎn)(T<,B>)組：用含有TGFβ<,1> 10 ng/ml的FSM培養(yǎng)HKCs 1h、12h、48h時(shí)，分為T<,B1>、T<,B2>、T<,B3>3個(gè)亞組；④TG

4、Fβ1+Wortmannin(T+W)組：采用10ng/mL TGF91+10nmol/LWortmannin培養(yǎng)HKCs 12或48h；⑤氯化鋰(LiCl，L)組：用20mmol/L培養(yǎng)HKCs 48h。倒置相差顯微鏡觀察HKCs的形態(tài)變化；分別用免疫組化、RT-PCR和Western blot檢測E-cadherin、α-SMA、β-catenin、總GSK-3β和磷酸化GSK-3β(Ser 9)蛋白和mRNA表達(dá)的變化。

5、結(jié)果: 1、細(xì)胞形態(tài)觀察①C組：HKCs細(xì)胞呈卵石樣緊密排列生長；②T<,A>組：TGFβ<,1>培養(yǎng)至48h時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)顯著的形態(tài)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞呈梭形，長短徑比例增加，細(xì)胞之間間隙增大，部分細(xì)胞和附近的細(xì)胞脫離接觸，失去卵石樣形態(tài)；T<,A1>組細(xì)胞部分呈現(xiàn)梭形，細(xì)胞長短徑比例增加較其他兩組為小；T<,A2>組和T<,A3>組HKCs在培養(yǎng)48h后均呈現(xiàn)典型梭形；③T+W組：細(xì)胞呈卵圓形，與C組細(xì)胞形態(tài)相似。 2、E-

6、cadherin表達(dá)水平的檢測①C組：免疫組化檢測到正常HKCs細(xì)胞胞膜和胞漿E-cadherin蛋白表達(dá)均為陽性，RT-PCR、Western blot均有高表達(dá)。②T<,A2>組：免疫組化結(jié)果呈陰性，RT-PCR、Western blot結(jié)果顯示10ng/ml TGFβ<,1>刺激HKCs 48 h后，E-cadherin蛋白表達(dá)較C組顯著減少，且組間降低水平具有顯著性差異。③T+W組：免疫組化E-cadherin蛋白表達(dá)呈陽性，R

7、T-PCR、Western blot均有高表達(dá)。 3、α-SMA表達(dá)水平的檢測①C組：免疫組化、RT-PCR和Western blot檢測均顯示正常HKCs中α-SMA的蛋白表達(dá)為陰性。②T<,A2>組：在不同濃度TGFβ<,1>刺激48h后，α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)較C組明顯增加，且組間增高水平具有顯著性差異。③T+w組：α-SMAm RNA和蛋白表達(dá)均較T<,A2>組顯著減少，其中免疫組化和RT-PCR結(jié)果為陰性，僅W

8、estern blot發(fā)現(xiàn)有微量表達(dá)。 4、GSK-3β的表達(dá)及Wortmannin干預(yù)①C組：免疫組化顯示總GSK-3β表達(dá)呈陽性，磷酸化GSK-3β(Ser 9)[phosphorylated-GSK-3β(Ser 9)，p-GSK-3β(Ser 9)]陰性；RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示GSK-3β mRNA和蛋白均有表達(dá)，但Western blot發(fā)現(xiàn)p-GSK-3β(Ser 9)有微弱表達(dá)；②T組(包括

9、T<,A>、T<,B>組)：免疫組化顯示總GSK-3β和p-GSK-3β(Ser 9)蛋白表達(dá)均呈陽性，GSK-3β mRNA和總蛋白在各組間表達(dá)量無顯著差異(P> 0.05)，和C組相比各T組GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著升高(P<0.01)；③T+W組：免疫組化結(jié)果p-GSK-3β(Ser 9)呈陰性，GSK-3β mRNA和總蛋白在各組間表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，和T組相比GSK-3β蛋白磷酸化水平顯著降低(P<0.01)

10、。 5、GSK-3β對其下游效應(yīng)分子β-catenin的影響①C組：正常HKCs主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜表達(dá)β-catenin，DAB染色可見棕黃色顆粒，RT-PCR和Western blot顯示β-catenin僅有少量表達(dá)；②T<,A1>組：經(jīng)過10ng/ml TGFβ<,1>處理48小時(shí)后，HKCs胞漿中的β-catenin轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，DAB顯色呈棕黃色顆粒，RT-PCR和Western blot顯示β-catenin表達(dá)

11、顯著增加；③T+W組：用TGFβ<,1>和Wortmannin共同培養(yǎng)HKCs，DAB染色主要在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜可見棕黃色顆粒，RT-PCR和Western blot顯示β-catenin表達(dá)較T<,A1>組顯著降低；④L組：用特異性GSK-3β抑制劑LiCl 20mmol/L培養(yǎng)HKCs 48h后，胞漿中的β-catenin轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，DAB顯色呈棕黃色顆粒，RT-PCR和Western blot顯示β-catenin表達(dá)顯著增加。