黃精多糖通過GSK-3β-β-catenin信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種老年退化性全身骨科疾病，主要特點為骨密度降低及骨微結(jié)構(gòu)破壞，易導(dǎo)致發(fā)生骨折，常見脊柱、髖和橈骨三個部位。隨著全球老年化社會到來，骨質(zhì)疏松癥已被列為僅次于心血管疾病的第二大危害人類健康的慢性疾病。骨質(zhì)疏松性骨折是一種可預(yù)防和治療的疾病，充分認(rèn)識老年骨質(zhì)疏松癥，早期預(yù)防和治療對骨質(zhì)疏松癥并發(fā)癥的發(fā)生有積極的臨床意義。當(dāng)前臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物從功能上分為兩種:促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收類藥物，具有費用

2、大、并發(fā)癥多及治療效果不佳等缺點，社會迫切需要開發(fā)經(jīng)濟(jì)和副作用少的新抗骨質(zhì)疏松藥物。天然植物化合物黃精多糖是藥食同源的黃精提取物，前面的研究發(fā)現(xiàn)黃精多糖具有增強免疫力、抗腫瘤和抗衰老等功能。前期的研究發(fā)現(xiàn)，黃精多糖通過促進(jìn)β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核激活經(jīng)典Wnt信號通路下游促進(jìn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞礦化，其具體分子機(jī)制仍不明確。本文探討黃精多糖通過GSK-3β/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化及其作用機(jī)制的研究。<

3、br>　　方法:
　　(1) BMSCs的分離及培養(yǎng)，鏡下觀察小鼠骨髓間充干細(xì)胞增殖和生長情況;
　　(2) shRNA-LRP5病毒轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞，設(shè)置三組MOI=20，40，60，倒置熒光顯微鏡下觀察CON組、NC組及shRNA-LRP5組綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá);
　　(3) Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測對shRNA-LRP5病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞增殖的影響；
　　(4)重

4、組慢病毒shRNA-LRP5轉(zhuǎn)染小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，嘌呤霉素篩選一周后，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測LRP5基因表達(dá)及蛋白印跡法(WB)檢測LRP5蛋白表達(dá)，檢測shRNA-LRP5病毒轉(zhuǎn)染BMSC細(xì)胞沉默效率;
　　(5)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天、21天后，使用qRT-PCR分別檢測shRNA-LRP5組、Con組及NC組中的BMSCs中促進(jìn)成骨相關(guān)的標(biāo)志基因(ALP、Runx2、OCN)的基因表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附測

5、定法(ELISA法)檢測成骨相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá);
　　(6) shRNA-LRP5組、Con組及NC組分別加入成骨誘導(dǎo)液含PBS緩沖液、黃精多糖及Wnt3a誘導(dǎo)21天后，堿性磷酸酶染色(ALP染色)鑒定BMSCs轉(zhuǎn)化成骨細(xì)胞，堿性磷酸二酯酶檢測試劑(PNP比色法)檢測堿性磷酸酶活性;誘導(dǎo)28天后，茜素紅染色（ARS）鑒定成骨細(xì)胞礦化及茜素紅染色定量檢測礦物結(jié)節(jié);
　　(7) TOPflash/FOPflashdual-luci

6、ferase report gene(雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測，TOPFLASH和陰性對照FOPFLASH)檢測檢測β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)作為轉(zhuǎn)錄因子的活性;
　　(8)western blot(WB)檢測細(xì)胞總p-GSK-3β、GSK-3β蛋白及細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　(1)提取的骨髓基質(zhì)細(xì)胞呈貼壁生長，細(xì)胞生長狀態(tài)良好和增殖能力強，成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后可向成骨細(xì)胞分化，成骨細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

7、為梭形或纖維樣細(xì)胞。
　　(2)病毒轉(zhuǎn)染BMSCs后轉(zhuǎn)染96小時，細(xì)胞狀態(tài)良好，顯微鏡下可見表達(dá)綠色熒光蛋白的BMSCs占總細(xì)胞的90％以上。
　　(3) CCK-8法檢測shRNA-LRP5病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞增殖的影響，shRNA-LRP5、Con及NC組三組比較OD值無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(4)與Con組比較，qRT-RCR及Western blot檢測shRNA-LRP5病毒轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞沉默效率都達(dá)到70

8、％以上，NC組表達(dá)水平?jīng)]有明顯下降。
　　(5) shRNA-LRP5組、Con組及NC組加入成骨誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)14天、21天后，使用qRT-RCR分別檢測成骨基因的相對基因表達(dá)水平，ELISA法檢測成骨相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)水平，shRNA-LRP5與Con和NC組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義;Con和NC組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(6)堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶活性檢測、茜素紅染色及茜素紅染色定量檢測結(jié)果:在Con組及NC組中，黃精多

9、糖、Wnt3a都具有促進(jìn)成骨作用，黃精多糖、Wnt3a誘導(dǎo)比較，無統(tǒng)計學(xué)差異;shRNA-LRP5組中，只有加入黃精多糖治療組具有促進(jìn)成骨作用，黃精多糖與Wnt3a、 PBS緩沖液誘導(dǎo)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，Wnt3a與PBS緩沖液誘導(dǎo)比較，數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　(7)與PBS緩沖液對比，Wnt3a處理后，Lueiferase活性檢測發(fā)現(xiàn)Con、NC組中TOPFLASH活性增強，而shRNA-LRP5組中轉(zhuǎn)錄活性沒有增高，黃精

10、多糖處理后，轉(zhuǎn)錄活性顯著增強。
　　(8)在Con組、shRNA-LRP5組中，與PBS緩沖液誘導(dǎo)比較，25mg/L黃精多糖促進(jìn)BMSC細(xì)胞核內(nèi)β-catenin蛋白表達(dá);p-GSK-3β總蛋白組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而GSK-3β總蛋白比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　(1)慢病毒介導(dǎo)的LRP5基因有效沉默小鼠骨髓間充干細(xì)胞的LRP5mRNA和蛋白，沉默LRP5基因阻止BMSCs成骨細(xì)胞分化。
　　(2)黃精