江蘇部分地區(qū)牛群腸出血性大腸桿菌分離株分子流行病學(xué)及EHEC O157：H7鞭毛蛋白單克隆抗體的研制.pdf

1、產(chǎn)志賀氏毒素大腸桿菌(shiga toxin-producing E. coli，STEC)是一群重要的腸道致病菌。目前至少有100多種血清型的大腸桿菌具有產(chǎn)志賀氏毒素的能力，其中血清型為0157：H7的菌株具較高致病力。通常將人類感染病例中分離的具有pO157質(zhì)粒、產(chǎn)生AE損傷(attaching and effacing lesion)的STEC菌株統(tǒng)稱為腸出血性大腸桿菌(entero-hemorrhagic E. coli，EHE

2、C)。EHEC主要包括O157:H7，026:H11和O111等幾種血清型，其中O157:H7作為典型菌株，主要通過食物傳播，健康家畜，特別是反芻動(dòng)物如牛、羊等被視作為該菌的天然帶菌動(dòng)物。該類細(xì)菌能夠引起人類腹瀉，出血性結(jié)腸炎(haemorrhagic colitis，HC)，溶血性尿毒綜合征(haemolytic uraemic syndrome，HUS)，血栓性血小板減少性紫癜(thromboticthrombocytopenic

3、purpura，TTP)等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。 鑒于EHEC對人類的高致病性，對該類細(xì)菌在自然界的流行特征、生物學(xué)特性、致病因子、感染機(jī)理及防治等各方面的深入研究顯得愈發(fā)重要?，F(xiàn)今，通過分子生物學(xué)、免疫學(xué)等手段實(shí)現(xiàn)EHEC的快速臨床檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。通過對毒力因子的深入研究，將促進(jìn)新的檢測、診斷方法的開發(fā)，為控制EHEC的流行提供有力手段；與此同時(shí)，將在進(jìn)出口檢驗(yàn)和公共衛(wèi)生方面具有一定的應(yīng)用前景。

4、 1.EHEC多重PCR檢測方法的建立及其分子流行病學(xué) 本研究基于ElIEC O157:H7 EDL933W株的stx1、stx2、eaeA、hlyA四個(gè)基因建立了多重PCR檢測方法。并運(yùn)用該多重PCR體系配合選擇性增菌、分離培養(yǎng)等-檢測手段，初步了解EHEC 0157、026、0111以及其他血清型的STEC大腸桿菌在牛群的帶菌和流行情況。研究期間共采集動(dòng)物糞便等樣品共計(jì)1128份，最終獲得分離株共計(jì)74株，分離率為6.

5、56％。所獲得菌株的毒力相關(guān)基因的攜帶表現(xiàn)出一定的多態(tài)性，其中屬于STEC的為30株，占分離株總數(shù)的40.54％。經(jīng)過血清學(xué)鑒定其中典型的EHEC血清型有026和0157，分離菌株數(shù)分別是23株和2株，各占已定型菌株的34.33％和2.99％，分別占采集樣品總數(shù)的2.04％和0.18％。結(jié)果表明，在牛群中非0157血清型的EHEC菌株如026等所占的比例更高。由此提示，牛糞可能是食品中EHEC污染的來源，因此控制大腸桿菌EHEC在牛場環(huán)

6、境中的存活與擴(kuò)散，加強(qiáng)牛肉及其制品以及牛奶中該類細(xì)菌的檢測，是防止人類發(fā)生EHEC感染的重要途徑之一。 2. EItEC感染ICR小鼠動(dòng)物模型的建立 本實(shí)驗(yàn)通過萘啶酮酸(nalidixic acid，Nal)飲水、絲裂霉素(mitomycin，MMC)腹腔注射并結(jié)合小鼠體內(nèi)傳代的方法初步建立了EHEC感染的ICR小鼠模型，復(fù)制出了人類感染EHEC所出現(xiàn)的部分臨床癥狀和主要病理變化。證實(shí)以109 CFU的EHEC灌服感染小

7、鼠，可致半數(shù)及以上的3周齡ICR小鼠死亡，確定了小鼠的感染劑量，并初步掌握了各受試分離株的致病力；同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對感染小鼠的糞便排菌情況及細(xì)菌在各臟器的分布情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明感染小鼠的排菌時(shí)間均在14 d以上，糞便中細(xì)菌平均含量達(dá)104 CFU/g以上；實(shí)驗(yàn)組各受檢臟器的活菌分布基本一致，但以盲、結(jié)腸最多，可達(dá)107CFU/g以上。該動(dòng)物模型的成功建立對探索此類細(xì)菌的感染機(jī)制、毒力因子的致病作用有重要意義，并為其疫苗侯選株安全性的評

8、價(jià)打下基礎(chǔ)。 3. EHEC 0157:H7鞭毛蛋白單克隆抗體的研制 本研究以EHEC 0157:H7的滅活全菌與粗提的鞭毛蛋白作為免疫原，利用細(xì)胞融合技術(shù)獲得了10株分泌抗EHEC 0157:H7單克隆抗體(monoclonal antibodies，MAbs)的雜交瘤細(xì)胞株，用間接ELISA法測定其免疫球蛋白亞類，并結(jié)合ELISA法、凝集法和’Westem blot鑒定單抗的特異性。結(jié)果顯示，其中6株僅與血清型為01

9、57的大腸桿菌參考株和分離株反應(yīng)，與其他受試菌株均不反應(yīng)。結(jié)合ELISA效價(jià)與直接凝集價(jià)，雜交瘤細(xì)胞株7E2、4E2、1D7的效價(jià)最高，特異性較強(qiáng)。由粗提鞭毛蛋白作為免疫原的1株單抗1A6僅與EHEC 0157:H7菌株及同樣表達(dá)H7鞭毛的026血清型的STEC H8反應(yīng)，與血清型為0157的非EHEC E.coli不發(fā)生反應(yīng)；經(jīng)ELISA與Western blot鑒定該株的抗原結(jié)合位點(diǎn)是鞭毛蛋白抗原。鑒于該株單抗較高的特異性，在制備檢