短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑對動物凝血、循環(huán)、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響.pdf

1、蛇毒中含有較多的影響血液系統(tǒng)功能的活性組分，如：凝血酶樣酶、解離素、纖溶酶、纖溶酶原激活劑、凝血X因子激活劑等，特別是在蝮科和蝰科蛇毒中尤為突出。
　　 1993年，中科院昆明動物研究所的張云等[1]首先報道從竹葉青蛇(Trimeresurus stejnegeri)蛇毒中分離純化出具有激活纖溶酶原作用的蛋白酶(TSV-PA)，并對TSV-PA的大量后續(xù)研究，為新型溶栓藥物的開發(fā)提供了新的思路。本實驗室已成功從江浙短尾蝮(Glo

2、ydius brevicaudus)蛇毒中分離純化出短尾蝮蛇毒纖溶酶原激活劑(plasminogen activator of Gloydius brevicaudusvenom，GBV-PA)，并通過動物實驗發(fā)現(xiàn)它對動物實驗性血栓具有治療和預防作用。為了全面了解GBV-PA的藥理學特點，本課題擬研究GBV-PA對動物凝血系統(tǒng)的影響和并觀察其一般藥理學作用，為進一步的開發(fā)研究提供資料。
　　 1.GBV-PA的分離純化及部分理化

3、性質(zhì)測定
　　 1.1 GBV-PA的分離純化
　　 短尾蝮蛇粗蛇毒用苯甲脒-瓊脂糖凝膠(Benzamide SepharoseTM4 Fast Flow)親和層析，得到兩個蛋白峰，收集具有酶活性的第二峰，經(jīng)濃縮后再用Superdex G-30凝膠過濾層析進一步純化，得到2個蛋白峰，纖維蛋白平板法鑒定第Ⅱ峰的降支具有激活纖溶酶原，間接溶解纖維蛋白的作用，該組分再過Lichrospher C184.6/250反相色譜柱，得

4、到2個蛋白峰，經(jīng)纖維蛋白平板法鑒定得到第Ⅱ峰具有間接溶解纖維蛋白作用，既GBV-PA。
　　 1.2 GBV-PA的理化性質(zhì)
　　 GBV-PA經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，在β-巰基乙醇還原和非還原條件下，均顯示單一條帶，即其為單一肽鏈的蛋白質(zhì)，分子量為40kDa左右。
　　 1.3 GBV-PA對小鼠的急性毒性
　　 按照化學藥物急性毒性試驗技術(shù)指導原則測定GBV-PA對小

5、鼠的急性毒性。做了一個初始劑量360μg.kg-1小鼠預試驗，觀察期內(nèi)小鼠不出現(xiàn)急性毒性，以2倍的倍數(shù)遞增劑量，128倍劑量時小鼠仍不出現(xiàn)急性毒性。給予小鼠最大給藥濃度、最大給藥體積劑量，進行最大耐受量(Maximal tolerance dose，MTD)實驗，小鼠未見其他異常反應。表明GBV-PA靜脈注射給藥不能獲得對小鼠的LD50，單次給藥也無明顯毒性反應。
　　 2.GBV-PA對家兔凝血功能的影響
　　 取健康

6、家兔30只，雌雄各半，隨機分為5組即：GBV-PA75μg.kg-1、150μg.kg-1、300μg.kg-1、生理鹽水陰性對照組和UK陽性對照組。分別于用藥前，用藥后60min取血2ml，以3.8％枸櫞酸鈉(9：1)抗凝。制備貧血小板血漿(PPP)，測定兔血漿的PT、APTT、TT及凝血時間CT。結(jié)果家兔靜脈注射不同劑量的GBV-PA后，家兔的凝血時間CT從原來的108s左右延長到120s～158s，家兔的APTT從原來的40s左右

7、延長到68s～153s，家兔的PT從原來的16s左右延長到48s～93s，TT則從原來的20s左右延長到98s～150s，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。
　　 3.GBV-PA對動物循環(huán)、呼吸和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響
　　 3.1 GBV-PA對小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的影響
　　 觀察GBV-PA對小鼠自主行為活動、自發(fā)活動、協(xié)調(diào)運動和閥下戊巴比妥鈉催眠實驗的影響。結(jié)果小鼠靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1

8、后，與NS組比較，小鼠自主行為活動基本正常；與NS組比較，GBV-PA對小鼠自發(fā)活動次數(shù)影響無顯著性差異(p＞0.05)；與NS對照組和氯丙嗪陽性對照組比較，GBV-PA對小鼠的協(xié)調(diào)運動無影響；與安定陽性對照組和空白對照組比較，GBV-PA對各劑量組小鼠閾下劑量戊巴比妥鈉催眠亦無協(xié)同作用；表明靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1對小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)和精神系統(tǒng)均無明顯影響。
　　 3.2 GBV-PA對大鼠血壓和心率

9、的影響
　　 采用多導生物信號記錄儀觀察記錄麻醉大鼠給藥前后收縮壓(SAP)、舒張壓(DAP)、心率(HR)的變化。結(jié)果與NS對照組相比，靜脈注射GBV-PA90、360、720μg.kg-1后大鼠的SAP、DAP、MAP和HR變化無顯著性差異。
　　 3.3 GBV-PA對麻醉大鼠呼吸功能的影響
　　 將張力傳感器用手術(shù)線連接并固定于動物劍突皮膚處，信號連接于多導生物信號記錄儀，測定麻醉大鼠給藥前后的呼吸頻率和

10、呼吸幅度，同時用Ⅱ?qū)?lián)心電電極測定大鼠的心電圖。結(jié)果與NS對照組相比，靜脈注射GBV-PA75、150和300μg.kg-1對大鼠呼吸頻率和呼吸幅度和心電圖無明顯影響。
　　 結(jié)論：小鼠靜脈注射GBV-PA46mg/kg未見明顯毒性；家兔iv GBV-PA75、150和300μg.kg-1血漿的PT、APTT、TT、CT顯著延長，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；靜脈注射GBV-PA90、360和720μg.kg-1對小鼠的自發(fā)活動、自主行