基于APRIL突變體的新型抗腫瘤分子的篩選與初步鑒定.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文基于APRIL突變體的新型抗腫瘤分子的篩選與初步鑒定姓名：高全勝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：黃復(fù)生20060501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文2 ．構(gòu)建了經(jīng)H E L T h 表位修飾、缺失不同區(qū)域的s A P R I L c D N A 突變體( m s A P R I Lc D N A )借助P C R ，以p Q E ．8 0 L ／s A P R I L 為模板，分別克隆缺失不同區(qū)域的s A

2、P R I L e D N A突變體，通過核酸連接技術(shù)在相應(yīng)缺失端加入H E L T h 表位。3 ．構(gòu)建了突變體原核表達(dá)載體將經(jīng)H E L T h 表位修飾、缺失不同區(qū)域的s A P R I L c D N A 突變體分別克隆于原核表達(dá)載體p Q E ．8 0 L ，測(cè)序證實(shí)序列正確。4 ．制備了融合蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)s A P R I L 及各融合蛋白表達(dá)，并借助W e s t e r n b l o t 鑒定表達(dá)產(chǎn)物。5 ．純化

3、了蛋白產(chǎn)物表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)S D S ．P A G E 檢測(cè)，主要以包涵體形式存在。用N i o N T A 柱純化包涵體溶解物，目的蛋白洗脫液經(jīng)多步透析法復(fù)性后冷凍抽干，獲得一定量各種純化蛋白。6 ．篩選出不具有s A P R I L 生物活性的突變體蛋白借助M T T 法證實(shí)：N 、C 端均連接H E LT h 表位的重組s A P R I L 突變?nèi)诤系鞍祝湓隗w外能刺激R a j i 細(xì)胞增殖；經(jīng)H E LT h 表位修飾，N ／C

4、端缺失4 5 b p ( 簡(jiǎn)稱C 、D )或9 0 b p ( 簡(jiǎn)稱E 、F ) 的s A P R I L 突變?nèi)诤系鞍?，其在體外不能刺激R a j i 細(xì)胞增殖。由此表明，已成功制備不具活性的s A P R I L 突變體C 、D 、E 和F ，且H E LT h 表位加入并不影響s A P R I L 活性。7 ．探討了不具生物活性的突變?nèi)诤系鞍渍T導(dǎo)小鼠產(chǎn)生多克隆抗體的作用將C 、D 、E 和F 純化蛋白加佐劑后免疫小鼠，經(jīng)E L

5、I S A 和W e s t e r n b l o t 鑒定，融合蛋白能刺激小鼠產(chǎn)生多克隆抗體，同時(shí)獲得抗C 、D 、E 和F 的抗血清。8 ．探討了抗s A P R I L 突變體多抗對(duì)s A P R I L 生物活性的影響采用M T T 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：抗C 、D 、E 和F 抗血清可分別抑制s A P R I L 促R a j i 和J u r k a t細(xì)胞增殖作用( 但抗F 抗血清對(duì)s A P R I L 促R a j i 細(xì)胞增

6、殖作用無影響) ，其中以抗D 抗血清抑制效果最強(qiáng)。9 ．探討了突變體D 及其抗血清的生物學(xué)作用用突變體D 免疫無滲漏的S C I D 小鼠，采用E L I S A 和W e s t e r n b l o t 鑒定抗體產(chǎn)生，M T T 檢測(cè)該多克隆抗體對(duì)s A P R I L 促R a j i 和J u r k a t 細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：成功獲得抗人s A P R I L 的多克隆交叉抗體；該多克隆抗體能抑制s A P R I