新型抗體結(jié)合分子AL插入突變體的體外分子進化研究.pdf

1、免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Immunoglobulin(Ig)-binding proteins，IBPs)是細菌產(chǎn)生的能夠與抗體結(jié)合的一類蛋白，在發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。其中最重要的三種代表分子為金黃色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SpA)，鏈球菌蛋白G(Streptococcal protein G，SpG)和部分大消化鏈球菌表面蛋白L(Peptostreptococcusmagnus protein

2、L，PpL)。IBPs由多個高度同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域頭尾相連構(gòu)成，每個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了與抗體結(jié)合的基本單位，保留了全部結(jié)合活性。
　　本室應用噬菌體展示體外親和篩選的進化方法獲得了由SpA A結(jié)構(gòu)域和PpL B3結(jié)構(gòu)域串聯(lián)而成的非天然存在的新型抗體結(jié)合分子AL(Novel evolved Ig-bindingmolecules AL，NEIBM AL，以下簡稱為AL)，AL能夠與人和哺乳動物的各類抗體Fab段的VH3重鏈和κ輕鏈同時結(jié)合，

3、形成新的抗體結(jié)合模式。AL中，SpA A結(jié)構(gòu)域與VH3結(jié)合活性遠遠低于PpL B3與κ輕鏈結(jié)合的活性。對AL的SpA中A結(jié)構(gòu)域螺旋Ⅱ上的第27位和第34位氨基酸同時進行分子進化研究獲得與人IgG和人IgM抗體結(jié)合活性明顯增強的AL(VV)分子。然而，研究表明，AL(VV)主要通過增強SpAA中VH3結(jié)合界面的穩(wěn)定性實現(xiàn)結(jié)合活性的提高，其結(jié)合位點并未增加。
　　目的:構(gòu)建AL和AL(VV)插入突變體噬菌體展示文庫，應用人IgM進行分

4、子進化篩選，獲得結(jié)合活性增強的突變體，為病原體特異性抗體檢測、抗體純化和抗體吸附治療的進一步改進提供研究基礎。
　　方法:
　　1.構(gòu)建AL和AL(VV)插入突變體噬菌體展示文庫:應用PCR定點突變技術依次在AL中A結(jié)構(gòu)域的螺旋Ⅱ和螺旋Ⅲ之間，即第38和第39位氨基酸之間插入3、5、7、9個氨基酸(amino acids，aa)大小的隨機多肽構(gòu)建多個AL插入突變體展示文庫（庫A3、庫A5、庫A7和庫A9）;在AL(VV)中的

5、A結(jié)構(gòu)域的相同位置插入3個氨基酸大小的隨機多肽，構(gòu)建AL(VV)插入突變體噬菌體展示文庫（庫V3）。
　　2.插入突變體噬菌體展示文庫的體外進化親和篩選:以人IgM為誘餌分子，通過重復的“吸附-洗脫-擴增”的過程，對庫A3、庫A5、庫A7和庫V3進行多輪篩選，PCR鑒定每代篩選過程中含插入片段的噬菌體與空載體的噬菌體比例的變化情況，當空載體完全消失后即達到進化完全;制備篩選后文庫的單克隆噬菌體，應用噬菌體ELISA篩選IgM結(jié)合活

6、性提高的單克隆噬菌體，并對高結(jié)合活性的噬菌體進行序列測定。同時，我們還對庫A3和庫V3進行了競爭性篩選和兩輪常規(guī)性篩選后改為競爭性篩選的混合型篩選的研究。
　　3.高結(jié)合活性插入突變體分子的原核表達、純化及結(jié)合特性的分析:將抗體結(jié)合活性提高的插入突變體、AL和AL(VV)分別克隆到原核表達載體pET-32a(+)中構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中。IPTG少量誘導表達，Ni-NTA柱親和層析純化，SDS-P

7、AGE分析蛋白純度，超微量核酸蛋白測定儀測定蛋白濃度。應用ELISA、競爭性ELISA、SPR等實驗分析其與人IgG和入IgM結(jié)合特性。
　　4.抗-HIV ELISA臨床血清學檢測:辣根過氧化物酶標記抗體結(jié)合活性提高的插入突變體和AL和AL(VV)，用作酶標二抗，ELISA方法比較其抗-HIV的檢測效果。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建成功的4個插入突變體噬菌體展示文庫:庫A3、庫A5、庫A7和庫V3的庫容依次為3.2×1

8、06、2.04×106、1.8×106和3.1×106;滴度依次為2.3×1012、2.1×1012、1.9×1012和2.2×1012(TU/ml)，能夠滿足后續(xù)的實驗要求;由于庫A9的庫容量(0.9×105)一直不達標故棄用。
　　2.庫A3經(jīng)過四輪常規(guī)分子進化篩選達到進化完全，挑取噬菌體ELISA結(jié)果中最高OD值的單克隆測序，獲得插入突變體ALI37-KTS;庫V3經(jīng)過三輪常規(guī)分子進化篩選達到進化完全，挑高OD值單克隆測序測

9、序，獲得插入突變體AL(VV)I37-KNQ;庫A5經(jīng)過五輪常規(guī)分子進化篩選達到進化完全，并未出現(xiàn)高結(jié)合活性插入突變體分子;庫A7經(jīng)過五輪常規(guī)分子進化篩選達到進化完全，挑取噬菌體ELISA結(jié)果中最高OD值的單克隆測序，獲得插入突變體ALI37-LTHQIST(在本次研究中并未進行深入研究)。庫A3和庫V3經(jīng)過競爭性篩選后，挑取噬菌體ELISA結(jié)果中最高OD值的單克隆測序，在庫A3中獲得插入突變體ALI37-TNQ，庫V3中獲得插入突變體

10、AL(VV)I37-NDD。庫A3和庫V3經(jīng)過混合型篩選后，挑取噬菌體ELISA結(jié)果中最高OD值的單克隆測序，在庫A3中獲得插入突變體ALI37-NNN，庫V3中獲得插入突變體AL(VV)137-NTQ。
　　3.將這六種插入突變體分子克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，成功的構(gòu)建了重組原核表達質(zhì)粒pET32a-ALI37-KTS、pET32a-ALI37-TNQ、pET32a-ALI37-NNN、 pET32a-AL(VV

11、)I37-KNQ、 pET32a-AL(VV)I37-NDD、 pET32a-AL(VV)I37-NTQ以及pET32a-AL和pET32a-AL(VV)，大量誘導表達后得到八種純度＞90％的蛋白，八種蛋白濃度分別為8.47、7.23、6.7、5.4、7.8、5.33、5.75、4.3(mg/mL)。
　　4.蛋白ELISA檢測結(jié)果顯示ALI37-KTS、 ALI37-TNQ、ALI37-NNN與人IgG和人IgM的結(jié)合活性均高于

12、AL， AL(VV)I37-KNQ、AL(VV)I37-NDD、 AL(VV)I37-NTQ與人IgG和人IgM的結(jié)合活性均高于AL(VV)。庫A3篩選得到的三種插入突變體進行相互之間的競爭性ELISA，結(jié)合活性的高低表現(xiàn)為: ALI37-NNN最高，其次是ALI37-TNQ,最低的為ALI37-KTS，與ELISA結(jié)果相同。SPR檢測的結(jié)果:親和力最強的為AL(VV)I37-NTQ，其次是AL(VV) I37-NDD，最低的為AL(V

13、V) I37-KNQ，親和力均高于AL(VV)。
　　5.八種蛋白AL、AL(VV)、ALI37-KTS、 ALI37-TNQ、ALI37-NNN、AL(VV)I37-KNQ、AL(VV)I37-NDD和AL(VV)I37-NTQ辣根過氧化物酶（HRP）標記后獲得HRP-AL、HRP-AL(VV)、HRP-ALI37-KTS、 HRP-ALI37-TNQ、HRP-ALI37-NNN、 HRP-AL(VV)I37-KNQ、HRP-A

14、L(VV)I37-NDD和HRP-AL(VV)I37-NTQ。用ELISA方法比較其與人IgM和IgG的結(jié)合活性，結(jié)果顯示HRP-ALI37-KTS、 HRP-ALI37-TNQ、HRP-ALI37-NNN的結(jié)合能力均高于HRP-AL，HRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I37-NTQ與人IgM和IgG的結(jié)合活性明顯高于HRP-AL(VV)。進而，我們用這8種酶標二抗對40份抗-HIV陽性臨床血清標本和40份正常獻血

15、員血清標本進行抗-HIV ELISA檢測顯示:8種酶標二抗對40份抗-HCV陰性正常獻血員血清標本的檢出效果相當;在3種AL插入突變體中，僅HRP-ALI37-NNN對40份抗-HIV陽性臨床血清標本的檢出效果明顯好于HRP-AL，顯示出明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.001);在3種AL(VV)插入突變體中，HRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I37-NTQ對40份抗-HIV陽性臨床血清標本的檢出效果明顯好于HRP-AL

16、(VV)，顯示出明顯的統(tǒng)計學差異(P＜0.001)。
　　結(jié)論:本研究成功進行了對NEIBM AL分子的體外分子進化改造，獲得了與人IgM和IgG結(jié)合活性明顯提高的AL、AL(VV)6種插入突變體分子，ALI37-KTS、ALI37-TNQ、ALI37-NNN、AL(VV)I37-KNQ、AL(VV)I37-NDD和AL(VV)B7-NTQ。其中，HRP-ALI37-NNNHRP-AL(VV)I37-KNQ和HRP-AL(VV)I