脫落乳牙牙髓干細胞聚合體用于牙髓再生的實驗研究.pdf

1、牙髓再生是現(xiàn)今研究的熱點，最主要的研究方法是基于組織工程原理，利用間充質干細胞結合生物支架材料進行異位和原位的組織重建。目前實驗研究多數(shù)為前瞻性的組織學和動物模型探索，但至今尚未實現(xiàn)具有完整組織形態(tài)結構和良好生理功能的牙髓再生。此外由于間充質干細胞的應用方式和生物支架的材料性能存在倫理學限制和生物安全性驗證，要進行臨床試驗應用仍需進一步深入研究。
　　要真正實現(xiàn)具有生理功能性牙髓再生的臨床應用，種子細胞的來源、支架材料的選擇以及有

2、效的誘導微環(huán)境是亟待解決的關鍵問題。脫落乳牙牙髓干細胞（SHED）是源于脫落器官的一類處于發(fā)育早期的牙源性干細胞，具有良好的生物學性能，包括較高的增殖能力、更為廣泛的多向分化能力、以及良好的免疫調控能力；并且其臨床來源也更為廣泛，便于自體的組織再生應用。此外近年來出現(xiàn)的細胞聚合體（aggregate）是一種先進的組織工程學技術，其不但可以保持干細胞活性，擁有良好性能的生物支架-自分泌的細胞間基質，而且富含細胞生長和分化所需的誘導因子。本

3、研究擬通過乳牙牙髓干細胞聚合體的生物學性能檢測、牙髓牙本質復合體組織再生實驗，明確其用于全牙根牙髓再生的可行性，進而利用動物模型的治療實驗，探討乳牙牙髓干細胞聚合體治療年輕恒牙牙髓壞死的效果，以期為兒童牙體牙髓疾病治療提供新的治療理念和策略，并為臨床試驗應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。
　　第一部分脫落乳牙牙髓干細胞聚合體生物學性能的實驗研究
　　目的：明確脫落乳牙牙髓干細胞及其聚合體的生物學性能。
　　方法：分離和培養(yǎng)人

4、類脫落乳牙的牙髓干細胞與恒牙牙髓干細胞（DPSC），檢測并比較兩者分子表面標記、克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力；進而誘導制備SHED細胞聚合體，通過組織學、免疫組織化學方法檢測其生物學性能。
　　結果：脫落乳牙牙髓干細胞與牙髓干細胞均能夠陽性表達間充質來源的表面標志STRO-1，CD90和CD146，而造血系來源標志物CD34為陰性。SHED細胞在克隆形成能力、增殖水平、成骨成脂分化能力方面均高于DPSC。制備的SHED細

5、胞聚合體厚度適中、質地堅韌；HE染色觀察SHED細胞聚合體含有較多的未分化細胞以及豐富的細胞外基質；MASSON染色可見交聯(lián)呈網(wǎng)狀結構的膠原纖維。
　　結論：乳牙牙髓干細胞及其聚合體具有良好的生物學性能，是一類理想的種子細胞和適宜的牙髓再生應用方式。
　　第二部分乳牙牙髓干細胞聚合體構建牙髓牙本質復合體的實驗研究
　　目的：探索SHED細胞聚合體用于組織工程構建牙髓-牙本質復合體的實驗方法。
　　方法：收集正畸拔

6、除牙齒，根管清理并制備全長牙根組織支架；實驗組根管內植入SHED細胞聚合體，對照組根管內充填氫氧化鈣糊劑，而后移植裸鼠皮下孵育，術后3月組織學取材；獲取根管內的再生組織，細胞分離并培養(yǎng)，對其表面分子標記、克隆形成能力、增殖水平以及成骨成脂分化能力檢測并與SHED細胞進行對比；同時取材組織脫礦后利用HE、免疫組化染色等方法評估異位再生情況。
　　結果：組織學檢查發(fā)現(xiàn)實驗組的再生組織幾乎充盈整個根管，類似正常牙髓組織，免疫組化染色可見

7、組織中DSPP、CD31、NESTIN均為陽性表達，也證明其具有繼發(fā)性牙本質、成牙本質細胞層、血管及神經(jīng)組織結構；再生組織細胞具有與SHED細胞相同的表面分子標記，同時其克隆形成能力、增殖水平以及多向分化能力均與SHED細胞相似；免疫熒光染色顯示再生組織的大部分血管及神經(jīng)源于 SHED細胞分化而來；而對照組根管內可見鈣化團塊及肉芽結締組織的混雜結構。
　　結論：SHED細胞聚合體在牙根管內微環(huán)境中可以異位再生形成正常形態(tài)的牙髓-牙

8、本質復合體結構。
　　第三部分乳牙牙髓干細胞聚合體用于牙髓再生的動物學實驗
　　目的：利用動物實驗模型檢測小型豬（mini-pig）乳牙牙髓干細胞（SPED）細胞聚合體進行原位牙髓再生的應用效果。
　　方法：分離和培養(yǎng) Mini-Pig的乳牙牙髓干細胞，檢測和分析其細胞生物學行為，進而誘導制備 SPED細胞聚合體；建立年輕恒牙牙髓壞死的實驗動物模型，設置 SPED聚合體再生組、傳統(tǒng)根尖誘導成形治療組和正常牙髓對照組；術

9、后4月進行受試牙齒牙髓活力反應測試，而后常規(guī)組織學取材，利用HE、免疫組化、免疫熒光染色等方法觀察牙髓再生和牙根尖形成情況。
　　結果：放射學檢查顯示 SPED聚合體再生組牙根繼續(xù)發(fā)育，并且對機械刺激出現(xiàn)牙髓疼痛反應；組織學HE染色檢測發(fā)現(xiàn)再生組受試牙齒牙根繼續(xù)發(fā)育并形成正常的根尖形態(tài)，此外全長根管內可見類牙髓結構的再生組織；免疫組化和熒光染色可見組織中CD31、Nestin、CGRP、TRPV1、TRPM8表達陽性細胞的規(guī)則分布