用牙髓干細胞構建牙齒樣結構的實驗研究.pdf

1、牙髓干細胞是牙齒組織工程中重要的種子細胞，自2000年發(fā)現(xiàn)以來已經取得了許多突破性的認識和發(fā)現(xiàn)，但在牙髓干細胞的進一步研究和實際應用中，還有許多問題有待認識和解決，例如今后怎樣用它與其它一種或多種細胞構建復雜牙齒結構的問題，怎樣在體外培養(yǎng)中提供合適的微環(huán)境來誘導牙髓干細胞向特定方向分化的問題，尤其是向成牙方向分化的問題。本研究首次嘗試將人牙髓干細胞與異種牙胚上皮細胞構建異種嵌合體牙齒結構、檢測異種牙胚細胞條件培養(yǎng)基對其有何誘導作用以及將

2、牙髓干細胞與牙周膜干細胞進行復合來嘗試構建工程化牙根樣結構，以期為牙髓干細胞的進一步研究和應用奠定實驗基礎，為牙髓干細胞在今后牙齒組織工程的合理使用提供一些有益的提示和參考，并探索出用牙齒來源干細胞進行牙齒再生的一些新途徑和新方法。
　　所取得的主要結果如下：
　　一、用牙髓干細胞制備異種嵌合體牙齒
　　用酶消化法培養(yǎng)了牙髓干細胞，結果顯示所培養(yǎng)的牙髓干細胞形態(tài)典型，表達間充質干細胞標志物STRO-1、CD106、CD

3、29，有克隆形成能力，經誘導后有成骨和成脂肪細胞能力，表明我們培養(yǎng)的細胞是來源于間充質的干細胞。另外分離獲得豬第三磨牙牙胚并培養(yǎng)牙胚細胞，用差速消化法純化獲得牙胚上皮細胞，免疫細胞化學鑒定顯示其對CK14、AMBN陽性表達，而對Vimentin陰性表達。然后將人牙髓干細胞和豬的牙胚上皮細胞以不同方式復合植入到裸鼠皮下，6周后取材。結果發(fā)現(xiàn)大部分移植物沒有形成任何有序的結構形態(tài)，但有一部分移植物中形成了含有類似牙本質、牙髓和牙釉質的牙齒樣

4、結構的組織，但是形成這種結構的概率較低。免疫組化結果證明我們形成的釉質樣結構來源于豬牙胚上皮，而牙本質樣結構源于人的牙髓干細胞。
　　本部分結果表明人的牙髓干細胞和豬的牙源性上皮細胞在體內，可以模擬類似牙胚發(fā)育時期的上皮-間充質相互作用方式，相互誘導，并有可能成功形成異種嵌合體結構。因而我們推斷可見只要進一步優(yōu)化條件，用人的牙齒間充質干細胞與異種的牙源性上皮細胞進行異種嵌合在牙齒再生中是有一定可行性的，并將可能成為解決牙釉質再生的

5、一條新途徑。
　　二、豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導人牙髓干細胞牙向分化的實驗研究
　　以前的實驗已經證實人牙胚條件培養(yǎng)基可以為人牙髓干細胞提供成牙微環(huán)境，誘導牙髓干細胞向成牙方向分化。但由于實際中應用人牙胚條件培養(yǎng)基并不可行，所以本實驗中我們驗證了用異種牙胚條件培養(yǎng)基來誘導人牙髓干細胞可行性。我們培養(yǎng)發(fā)育期豬的第三磨牙牙胚，并收集獲得牙胚條件培養(yǎng)基，同時培養(yǎng)人的牙胚并獲得人牙胚條件培養(yǎng)基。將豬和人的牙胚條件培養(yǎng)基分別誘導人的牙髓干細

6、胞，并從體內、體外比較了豬牙胚條件培養(yǎng)基和人牙胚條件培養(yǎng)基對人牙髓干細胞的誘導作用。結果表明：人牙髓干細胞經過一定時間的豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導后，能在細胞形態(tài)上和細胞周期上發(fā)生改變，能具有更高的克隆形成能力和多向分化能力，能維持更好的干細胞特性，具有更強的增殖能力，表達更高水平的堿性磷酸酶，免疫組化和RT-PCR提示誘導后的牙髓干細胞能在蛋白水平和基因水平表達出一些牙向分化的標志，如DSP、DSPP、DMP1、BSP、OCN、OPN等。此

7、外，經豬牙胚條件培養(yǎng)基誘導過的人牙髓干細胞植入裸鼠體內能獲得形狀更為規(guī)則的牙本質-牙髓復合體樣結構，而且形成這種規(guī)則結構的概率從20％提高到超過70％。這些結果與人牙胚條件培養(yǎng)基誘導的牙髓干細胞表現(xiàn)類似，但常規(guī)培養(yǎng)的人牙髓干細胞沒有表現(xiàn)出特別變化。
　　所得結果說明豬牙胚條件培養(yǎng)基擁有與人牙胚條件培養(yǎng)基一樣的能力，誘導人牙髓干細胞向成牙方向分化。這提示我們異種牙胚條件培養(yǎng)基有可能作為一種牙齒再生的有用工具，我們在今后的牙組織工程領

8、域，應用異種的牙胚條件培養(yǎng)基將有助于構建理想的工程化牙齒。
　　三、用人牙髓干細胞和牙周膜干細胞嘗試構建工程化牙根的實驗研究
　　牙髓干細胞和牙周膜干細胞是牙齒再生領域最有潛力的兩個成體干細胞，那把這兩種干細胞一起復合，能否在體內獲得牙根樣結構呢？本實驗進行了這方面的初步嘗試。我們體外培養(yǎng)了人牙周膜干細胞并對其性質進行了鑒定，結果顯示牙周膜干細胞對Vimentin染色陽性，CK陰性，顯示其為間充質來源，STRO-1呈陽性染色

9、，說明培養(yǎng)的牙周膜干細胞具有間充質來源干細胞的表型特點。成脂、成骨誘導實驗驗證了牙周膜干細胞的多向分化能力與可塑性。本研究中將人的牙髓干細胞進行標記后，再與牙周膜干細胞以不同的方式復合并植入裸鼠體內，希望獲得有一定結構的工程化牙根。結果顯示：以牙根狀CBB為支架的復合物取材后肉眼觀呈外形良好的小牙根狀，HE染色表明所有移植物中都有礦化發(fā)生，且能在一部分移植物中發(fā)現(xiàn)有典型Sharpey纖維樣結構。在以CBB顆粒為支架的移植物中，肉眼觀是形

10、成了扁平狀的結構，HE染色結果顯示也能也有礦化現(xiàn)象發(fā)生，但礦化基質較牙根狀CBB為支架的標本少。而單純細胞團移植物除小部分出現(xiàn)了一定的礦化現(xiàn)象，大部分不能產生任何的有形結構。在三個實驗組中都沒有發(fā)現(xiàn)有典型牙髓牙本質復合體樣結構形成。
　　本實驗結果提示我們：在構建組織工程化牙根中，支架材料最好是有預成形狀的，以引導相關干細胞沿著支架生長并形成大體結構良好的牙齒樣組織；另外多種細胞構建一定結構時，不同的種子細胞最好是分別復合到支架上