實(shí)時(shí)定量PCR分析腸道正常菌群及其在實(shí)驗(yàn)性肝損傷研究中的初步應(yīng)用.pdf

1、當(dāng)前研究顯示肝臟和腸道微生態(tài)不僅在解剖結(jié)構(gòu)上，而且在功能上都存在著密切的關(guān)系。腸道內(nèi)寄居著種類繁多，數(shù)量巨大的細(xì)菌，是機(jī)體內(nèi)最大的儲(chǔ)菌庫(kù)和內(nèi)毒素池，是內(nèi)源性感染和內(nèi)毒素血癥的主要來源。在正常情況下，腸道正常菌群與黏膜表面的粘蛋白、sIgA、完整的腸黏膜結(jié)構(gòu)及腸壁免疫細(xì)胞共同構(gòu)成了腸道的黏膜屏障系統(tǒng)，阻止了腸道細(xì)菌，內(nèi)毒素向腸外移位。在某些病理情況下如重型肝炎，肝硬化，嚴(yán)重?zé)齻?，小腸移植等均可以出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡，腸壁屏障功能損傷，細(xì)菌移

2、位以及腸源性內(nèi)毒素血癥。 近來實(shí)驗(yàn)研究和臨床資料多集中于肝衰竭、肝硬化對(duì)腸道微生態(tài)的影響，但主要基于直腸糞便樣本的分析，結(jié)果顯示雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌下降而腸桿菌等有害菌升高的趨勢(shì)。有關(guān)肝損傷的腸道微生態(tài)變化研究資料不多，各腸段正常菌群數(shù)量和分布規(guī)律未見報(bào)道。臨床上對(duì)腸道正常菌群的定量分析主要采用傳統(tǒng)分析方法，但費(fèi)時(shí)、易受操作影響，近幾年來有研究采用基于16SrRNA基因有關(guān)的實(shí)時(shí)定量PCR(Real-TimePCR)技術(shù)定量

3、分析腸道菌群演替規(guī)律，資料不多且缺乏比較。為進(jìn)一步弄清肝損傷時(shí)腸道微生態(tài)變化及大腸各節(jié)段正常菌群分布規(guī)律，我們采用種屬特異性探針結(jié)合Real-TimePCR技術(shù)，定量分析正常和肝損傷動(dòng)物模型的不同大腸節(jié)段微生態(tài)狀況，設(shè)計(jì)進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。 第一部分：Real-TimePCR檢測(cè)不同腸段腸道正常菌群及與傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)果的比較 材料與方法： 1.研究對(duì)象SD大鼠6只，雌雄各半，體重150±10g。 2.研究標(biāo)本新鮮

4、糞便 3.研究方法 3.1傳統(tǒng)培養(yǎng)方法定量分析腸道正常菌群。 3.2含有腸道目標(biāo)細(xì)菌特異性16SrRNA基因片段的質(zhì)粒DNA構(gòu)建、克隆建庫(kù)及測(cè)序。 3.3熒光定量PCR定性、定量分析大腸不同節(jié)段內(nèi)容物目的細(xì)菌群。 3.4SPSSf0rWindows用于統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分析正常大鼠不同節(jié)段腸道正常菌群顯示，各分析菌群在空腸、回腸迅速升高，盲腸達(dá)到峰值，結(jié)腸和直腸各菌群

5、數(shù)量較盲腸變化不明顯(p＞0.05)。小腸內(nèi)容物總DNA采用試劑盒未能提取。Real-TimePCR分析顯示，各分析目的菌群在盲腸、結(jié)腸和直腸檢測(cè)結(jié)果變化不明顯。兩種檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果相比較，各菌群數(shù)值在大腸各節(jié)段變化規(guī)律是一致的。 第二部分：Real-TimePCR定量分析急性肝損傷模型腸道微生態(tài)狀況及相關(guān)干預(yù)的影響 實(shí)驗(yàn)分組：將SD大鼠分成五組(每組10只動(dòng)物) (1)正常對(duì)照組：正常大鼠，2ml滅菌水。

6、 (2)對(duì)照組：急性肝損傷大鼠模型，2ml滅菌水。 (3)甘利欣組：急性肝損傷大鼠模型，甘利欣15mg/kg·d灌胃。 (4)肝生元組：急性肝損傷大鼠模型，GSY-145mg/kg·d灌胃。 (5)螺旋藻組：急性肝損傷大鼠模型，螺旋藻500mg/kg·d灌胃。 各組于造模前5日開始灌胃，造模后48h處死動(dòng)物采集標(biāo)本，每組隨機(jī)挑選3只雌鼠和3R雄鼠，共6只動(dòng)物用于分析盲腸、結(jié)腸和直腸3個(gè)腸段正常菌群構(gòu)成，

7、并與傳統(tǒng)方法結(jié)果比較。所有動(dòng)物均檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平，腫瘤壞死因子水平，肝功能以及肝臟的病理改變。 結(jié)果： 1.急性肝損傷對(duì)照組大鼠出現(xiàn)明顯的腸道菌群紊亂，Real-TimePCR與傳統(tǒng)方法定量分析盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物菌群狀況，3個(gè)節(jié)段表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌的增加(與正常對(duì)照組比較P＜0.01)，雙歧桿菌下降(與正常對(duì)照組比較P＜0.01)。血清ALT，AST，血漿內(nèi)毒素水平和腫瘤壞死因子α水平升高(與正常對(duì)照組比較

8、P＜0.01)。 2.造模前給予甘利欣，肝生元和螺旋藻均可降低造模后2日的內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子水平(與對(duì)照組比較，P＜0.01)。肝生元和螺旋藻組雙歧桿菌數(shù)量增加(與對(duì)照組比較，P＜0.01)，腸球菌和桿菌降低(與對(duì)照組比較，P＜0.01)。與對(duì)照組比較，甘利欣組調(diào)節(jié)菌群效果不明顯(P＞0.01)。在干預(yù)因素存在下，定量分析急性肝損傷動(dòng)物模型不同腸段菌群，Real-limePCR檢測(cè)所獲結(jié)果與應(yīng)用傳統(tǒng)方法獲得的結(jié)果存在一致性。

9、 第三部分：Real-TimePCR定量分析慢性肝損傷模型腸道微生態(tài)狀況及相關(guān)干預(yù)的影響 實(shí)驗(yàn)分組：將SD大鼠分成五組(每組10只動(dòng)物) (1)正常對(duì)照組：正常大鼠，2ml滅菌水。 (2)對(duì)照組：慢性肝損傷大鼠模型，2ml滅菌水。 (3)甘利欣組：慢性肝損傷大鼠模型，甘利欣15mg/kg·d灌胃。 (4)肝生元組：慢性肝損傷大鼠模型，GSY-145mg/kg·d灌胃。 (5)螺旋藻組

10、：慢性肝損傷大鼠模型，螺旋藻500mg/kg·d灌胃。 各組于造模前3月前開始灌胃，皮下注射CC14每周1次造模，劑量為0.2ml/kg；每次注射前CC14用花生油稀釋，濃度逐漸遞增，即每2周遞增5％，依次為5％、10％、15％、20％、25％、30％；連續(xù)3個(gè)月，共注射12次。末次造模后48h處死動(dòng)物采集標(biāo)本，每組隨機(jī)挑選3只雌鼠和3R雄鼠，共6只動(dòng)物用于分析盲腸、結(jié)腸和直腸3個(gè)腸段正常菌群構(gòu)成。所有動(dòng)物均檢測(cè)血漿內(nèi)毒素水平，

11、腫瘤壞死因子水平，肝臟纖維化，肝功能以及肝臟的病理改變。 結(jié)果： 1.實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷對(duì)照組大鼠出現(xiàn)明顯的腸道菌群紊亂，Real-TimePCR與傳統(tǒng)方法定量分析盲腸、結(jié)腸和直腸內(nèi)容物菌群狀況，3個(gè)節(jié)段均表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌和腸球菌的增加(與正常對(duì)照組比較P＜0.01)，雙歧桿菌下降(與正常對(duì)照組比較P＜0.01)。血清ALT，AST，血漿內(nèi)毒素水平和腫瘤壞死因子α水平升高(與正常對(duì)照組比較P＜0.01)，PLD、TGF-

12、β1和HA三個(gè)肝纖維化指標(biāo)亦非常顯著增高(P＜0.01) 2.造模前給予甘利欣，肝生元和螺旋藻均可降低造模后2日的內(nèi)毒素和腫瘤壞死因子水平(與對(duì)照組比較，P＜0.01)。肝生元和螺旋藻組雙歧桿菌數(shù)量增加(與對(duì)照組比較，P＜0.01)，腸球菌和桿菌降低(與對(duì)照組比較，P＜0.01)。與對(duì)照組比較，甘利欣組調(diào)節(jié)菌群效果不明顯(P＞0.01)。在干預(yù)因素存在下，定量分析慢性肝損傷動(dòng)物微生態(tài)，Real-TimePCR檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法結(jié)

13、果存在一致性。 結(jié)論： 應(yīng)用Real-TimePCR技術(shù)分析證實(shí)，急性和慢性肝損傷后均存在較明顯的腸道微生態(tài)的紊亂；而肝生元和螺旋藻能在一定程度上改善實(shí)驗(yàn)性肝損傷后腸道菌群失衡，增加腸道的定植抗力，降低血內(nèi)毒素水平，起到一定護(hù)肝作用。 本研究結(jié)果提示，Real-TimePCR技術(shù)分析不同腸大腸節(jié)段正常菌群所獲得的結(jié)果，在正常動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)性肝損傷動(dòng)物模型以及干預(yù)因素存在條件下，與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法有很好的一致性，且具有便捷