急性心肌梗死經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植前后Cx43、Cx45與心電生理變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：⑴從新生大鼠的骨髓中分離出MSCs，進(jìn)行體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定，探討MSCs向心肌細(xì)胞定向分化的潛能，為MSCs移植治療MI奠定基礎(chǔ)。⑵建立穩(wěn)定的MI大鼠模型，MSCs體外標(biāo)記后移植，觀察MI大鼠經(jīng)MSCs移植后左室功能和病理的變化。⑶探討MSCs移植對(duì)AMI后心電生理的影響，為進(jìn)一步研究MSCs移植與心律失常的關(guān)系建立基礎(chǔ)。⑷探討經(jīng)5-aza體外誘導(dǎo)后的MSCs移植對(duì)MI后Cx43/Cx45重構(gòu)的影響及其與心律失常的關(guān)系。

2、 方法：①抽取Wistar大鼠骨髓液，采用密度為1.073的percoll細(xì)胞分離液，通過(guò)密度梯度離心法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，利用細(xì)胞貼壁篩選法純化MSCs；以含10％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基添加青霉素和鏈霉素于37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)，以10μmol/L的5-溴脫氧尿核苷(5-aza)進(jìn)行體外誘導(dǎo)成心肌樣細(xì)胞并進(jìn)行α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)、心肌特異性肌鈣蛋白T(cTnT)和縫隙連接蛋白43(Cx

3、43)免疫組化鑒定，同時(shí)行透射電鏡觀察肌絲等細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。②Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(Nor組)、假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死+生理鹽水組(MI組)和MSCs移植組(MSCs組)，每組45只。提前抽取同種異體大鼠骨髓，體外擴(kuò)增MSCs達(dá)1×107，加入10μmol/L的5-aza誘導(dǎo)成心肌樣細(xì)胞，進(jìn)行長(zhǎng)期傳代和培養(yǎng)。③Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組(Nor組)、假手術(shù)組(Sham組)、心肌梗死+生理鹽水組(

4、MI組)和MSCs移植組(MSCs組)，每組45只。開(kāi)胸后在心外膜相應(yīng)區(qū)域置入1對(duì)魚(yú)鉤狀電極，電極連接心臟電生理刺激儀，心電圖機(jī)記錄標(biāo)準(zhǔn)2導(dǎo)聯(lián)心電圖。行4:1的S1S2負(fù)向掃描法測(cè)定VERP；行間斷S1S1刺激法測(cè)定VET；同時(shí)觀察并記錄程序刺激過(guò)程中所誘發(fā)的室性心動(dòng)過(guò)速(室速)的數(shù)量和類型。 結(jié)果：⑴MSCs通過(guò)密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法分離后，在含10％FBS的L-DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。體外培養(yǎng)24小時(shí)后即可貼壁生長(zhǎng)，7

5、～10天細(xì)胞迅速增殖，10～12天基本鋪滿瓶底。傳代后MSCs分布較均勻，呈扁平多角形、三角形和梭形等多種形態(tài)，排列密集。經(jīng)10μmol/L的5-aza誘導(dǎo)4周后，MSCs可分化為形態(tài)均一的長(zhǎng)梭形心肌樣細(xì)胞，排列方向趨于一致，偶可見(jiàn)自發(fā)搏動(dòng)的細(xì)胞，搏動(dòng)頻率10～20次/分，行免疫組化染色示α-actin、cTnT和Cx43陽(yáng)性表達(dá)。電鏡觀察示誘導(dǎo)后橫紋樣結(jié)構(gòu)形成，胞質(zhì)中有富集的糖原顆粒及肌絲形成。⑵采用開(kāi)胸結(jié)扎LAD的方法可有效建立大鼠

6、AMI模型，MI組和MSCs組大鼠7天存活率為87.8％。行二次開(kāi)胸細(xì)胞移植術(shù)，MI組總存活率為68.9％，MSCs組總存活率為80.0％。MSCs移植前DAPI的標(biāo)記率達(dá)100％；心臟彩超結(jié)果示，MI組干預(yù)后各周的LVIDd和LNIDs顯著增加，EF和FS則顯著下降；與MI組相比，MSCs組干預(yù)后各周的LVIDs減小，EF和FS則顯著增加。隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，MI組和MSCs組的LVIDd和LVIDs均持續(xù)增加，而EF和FS則持續(xù)下降

7、。⑶與Sham組相比，MI組各周ECG的PR間期、QRS時(shí)限、QT間期及QTc間期等均明顯延長(zhǎng)，VERP增加，VFT減小。與MI組相比，MSCs組干預(yù)后各周的PR間期、QRS時(shí)限和VERP縮短而VFT增加。不同周數(shù)間的比較，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，MI組和MSCs組的ECG各參數(shù)以及VERP和VFT均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。⑷ISCM觀察可見(jiàn)DAPI標(biāo)記帶藍(lán)色熒光的移植MSCs細(xì)胞核，呈小島樣分布且較廣泛，隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸減弱。同一切片

8、的多通道的激發(fā)光觀察發(fā)現(xiàn)移植的MSCs可表達(dá)Cx43。 結(jié)論：①M(fèi)SCs體外易于分離、純化和長(zhǎng)期培養(yǎng)。誘導(dǎo)可分化為自發(fā)搏動(dòng)的心肌樣細(xì)胞，表達(dá)α-actin、cTnT和Cx43并形成肌絲結(jié)構(gòu)。說(shuō)明MSCs具有較強(qiáng)的自我增殖能力和多向分化潛能，可作為移植治療MI的理想的細(xì)胞來(lái)源。②采用開(kāi)胸結(jié)扎LAD的方法可建立穩(wěn)定的AMI大鼠模型。同種異體MSCs移植可在宿主心肌里存活，并有效改善MI后左室功能，減小梗死面積。③同種異體MSCs移植