HCN4和Cx45基因?qū)腴g充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建起搏細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:利用慢病毒載體將小鼠超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道4(mHCN4)基因和小鼠連接子蛋白45(mCx45)基因?qū)氪笫蠊撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞(rMSC)，構(gòu)建生物起搏細(xì)胞。
　　方法:
　　1、從GeneBank查詢目的基因mHCN4、mCx45序列，化學(xué)合成cDNA并PCR擴(kuò)增，同源重組到pLenti-CMV-EGFP/RFP的EcoRⅠ位點(diǎn)，得到pLenti-CMV-HCN4-RFP、pLenti-CMV-Cx45-EG

2、FP重組慢病毒質(zhì)粒，用過四質(zhì)粒系統(tǒng)導(dǎo)入293T細(xì)胞包裝慢病毒，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定重組慢病毒和對(duì)照慢病毒pLenti-CMV-EGFP液的滴度。
　　2、采用骨髓腔沖洗法分離SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。采用胰酶消化法分離新生大鼠心肌細(xì)胞，差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞，每日觀察其搏動(dòng)情況。
　　3、用攜帶HCN4-RFP的慢病毒轉(zhuǎn)染rMSC作為實(shí)驗(yàn)組，用攜帶EGFP的對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染rMSC作為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后熒光顯微鏡下

3、觀察熒光表達(dá)情況，并行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率。利用電壓鉗記錄陽性轉(zhuǎn)染細(xì)胞的起搏電流If。將實(shí)驗(yàn)組(mHCN4-rMSC)和對(duì)照組(null-rMSC)分別與NRVM共培養(yǎng)，隔天記錄各組NRVM(n=6)的搏動(dòng)頻率。
　　4、用攜帶Cx45-EGFP的慢病毒轉(zhuǎn)染HCN4-rMSC，將共表達(dá)HCN4和C×45的rMSC作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為HCN4-rMSC，轉(zhuǎn)染72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，并行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染

4、效率。將實(shí)驗(yàn)組（mHCN4-Cx45-rMSC）和對(duì)照組(mHCN4-rMSC)分別與NRVM共培養(yǎng)，隔天記錄各組NRVM(n=6)的搏動(dòng)頻率。
　　結(jié)果:
　　1、mHCN4和mCx45基因分別成功重組到到pLenti-CMV-RFP和pLenti-CMV-EGFP質(zhì)粒中，通過四質(zhì)粒系統(tǒng)成功包裝出重組慢病毒pLenti-CMV-HCN4-RFP和pLenti-CMV-Cx45-EGFP，熒光實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定慢病毒液的滴

5、度分別為2.2×108TU/ml、1.93×108TU/ml，對(duì)照慢病毒pLenti-CMV-EGFP的滴度為1.89×109TU/ml。
　　2、分離培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)傳代后純度不斷提升，第3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)、大小基本相同，呈簇狀聚集，純度達(dá)到90％左右。分離的新生大鼠心室肌細(xì)胞接種前臺(tái)盼藍(lán)染色提示大約80％存活，培養(yǎng)至第3天時(shí)80％左右的心肌細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性收縮，頻率在60次/分左右;培養(yǎng)至第10天后心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率逐漸減

6、慢，至第14天基本停止搏動(dòng)。
　　3、慢病毒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組(HCN4-RFP)表達(dá)片狀紅色熒光，對(duì)照組(null-EGFP)表達(dá)片狀綠色熒光，流式細(xì)胞學(xué)熒光檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)組為（57.1±2.3）％，對(duì)照組為（62.3±2.1）％。實(shí)驗(yàn)組用電壓鉗記錄到高水平電壓-時(shí)間依從的超極化激活的內(nèi)向性起搏電流If，If通道激活的超極化電位為-80mV，而對(duì)照組未記錄到起搏電流。將rMSC與NRVM共培養(yǎng)4天后，

7、實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)NRVM的搏動(dòng)頻率76±4次/分顯著高于對(duì)照組的62±2次/分。
　　4、慢病毒轉(zhuǎn)染72小時(shí)后熒光顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組(HCN4-RFP+Cx45-EGFP)同時(shí)表達(dá)片狀紅色熒光和點(diǎn)狀綠色熒光，對(duì)照組（HCN4-RFP）表達(dá)片狀紅色熒光。流式細(xì)胞學(xué)熒光檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染效率實(shí)驗(yàn)組為（58.4±1.1）％，對(duì)照組為（57.1±2.3）％。將rMSC與NRVM共培養(yǎng)4天后，實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)NRVM的搏動(dòng)頻率93±4次/分顯著高于對(duì)