外源性褪黑激素對MPTP帕金森病小鼠作用的研究.pdf

1、目的：
　　 帕金森氏?。≒arkinson’disease，PD）是一種發(fā)生于中老年黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和黑質(zhì)紋狀體通路的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以靜止性震顫、肌肉強(qiáng)直、運(yùn)動減少、運(yùn)動遲緩和姿體平衡障礙為主要臨床特征?，F(xiàn)在臨床多采用左旋多巴替代內(nèi)源性多巴胺（Dopamine，DA）的缺乏，可改善PD癥狀，但大多數(shù)病人服藥一段時(shí)間后療效減退，出現(xiàn)運(yùn)動障礙、智力減退和精神癥狀等副作用。同時(shí)近年研究認(rèn)為PD發(fā)病與由自由基生成增多而自由

2、基清除能力下降所引起的氧化應(yīng)激致黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性有關(guān)。
　　 褪黑激素是由松果體分泌的一種吲哚類激素，是一種強(qiáng)大的天然抗氧化劑。國內(nèi)外的大量實(shí)驗(yàn)研究表明褪黑激素對多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用，從而緩解帕金森病癥狀。但是并未考慮周期性分泌的內(nèi)源性褪黑激素是否對其抗氧化效應(yīng)具有影響。故本研究擬在褪黑激素分泌的最高峰（23:00～2:00）和最低峰（12：00左右）分別給予小鼠外源性褪黑激素，然后對兩時(shí)間點(diǎn)的多巴胺能神經(jīng)元的作用進(jìn)

3、行對照，以探究內(nèi)源性褪黑激素是否對外源性褪黑激素的多巴胺能神經(jīng)保護(hù)作用有影響。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1-甲基，4-苯基，1，2，3，6-四氫吡啶（1-Methy4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）是一種脂溶性神經(jīng)毒素，能迅速通過血腦屏障，選擇性損毀黑質(zhì)多巴能神經(jīng)元，引起類似帕金森病的癥狀，為此本研究擬通過MPTP創(chuàng)建PD小鼠模型。
　　 選取健康成年C57BL/6

4、小鼠60只，雄性，10-12周齡，體重20-25g，動物自由進(jìn)食飲水，光照12/12h明暗交替，室溫飼養(yǎng)。飼養(yǎng)3日之后，將小鼠隨機(jī)分為四組：正常對照組（5只），PD組（15只），MPTP+日間MEL實(shí)驗(yàn)組（簡稱日間組）（20只）及MPTP+夜間MEL實(shí)驗(yàn)組（簡稱夜間組）（20只）。給予PD組，日間組及夜間組所有C57BL/6小鼠腹腔注射MPTP0.2ml/只，30mg·kg-，每日一次，連續(xù)7天。與此同時(shí)給予正常對照組小鼠腹腔注射無菌生

5、理鹽水0.2ml，同樣每日一次，連續(xù)7天。在實(shí)驗(yàn)的第8天，分別于每日12:00和凌晨1:00給予日間組小鼠和夜間組小鼠腹腔注射褪黑激素0.1ml/只，10mg·kg-，每日一次，連續(xù)7天，褪黑激素先用無水乙醇溶解。與此同時(shí)給予正常對照組及MPTP對照組小鼠腹腔注射無菌生理鹽水0.1ml/只，同樣每日一次，連續(xù)7天。然后常規(guī)麻醉后經(jīng)心臟灌流固定，取腦，制作71μm厚石蠟切片。
　　 酪氨酸羥化酶（tyrosinehydroxyla

6、se，TH）是腦內(nèi)多巴胺合成的限速酶，故分別采用TH免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Westernblot、免疫熒光及免疫電鏡等技術(shù)分析四組小鼠的黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 與正常對照組相比，PD組TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目、TH蛋白表達(dá)量、免疫熒光強(qiáng)度及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜免疫沉積物和電子密度明顯降低，而日間組沒有明顯變化。與PD組相比，日間組TH免疫陽性神經(jīng)元數(shù)目、TH蛋白表達(dá)量、免疫熒光強(qiáng)度及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜免疫沉積物和

7、電子密度明顯增加，但是夜間組沒有明顯變化。日間組和夜間組相比沒有顯著性差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、PD組黑質(zhì)及紋狀體TH免疫陽性反應(yīng)，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，TH蛋白表達(dá)量，TH免疫熒光強(qiáng)度，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜免疫沉積物及電子密度明顯低于正常對照組，表明MPTP對C57BL/6小鼠具有毒性作用，PD模型創(chuàng)建成功。
　　 2、日間組比PD組TH免疫陽性反應(yīng)，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，TH蛋白表達(dá)量，TH免疫熒光強(qiáng)度，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜免疫沉積物及電子密