微波消融聯(lián)合CpG ODN對肝癌的免疫治療效果研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌(HCC)惡性程度高，發(fā)病快，就診時常屬中晚期，手術(shù)切除率低，肝癌肝切除術(shù)后的5年復(fù)發(fā)率43％～61％，5年生存率為35％～42％，預(yù)后差。治療的主要難點(diǎn)是腫瘤的高度復(fù)發(fā)傾向和轉(zhuǎn)移。隨著分子生物學(xué)、腫瘤免疫治療學(xué)的發(fā)展，人們不斷尋找新的有效治療方法。 隨著人們對腫瘤免疫學(xué)認(rèn)識的不斷深入，愈來愈多的研究顯示腫瘤免疫治療是一種行之有效的治療手段。目前，腫瘤免疫治療主要包括細(xì)胞因子治療，過繼性免疫治療，導(dǎo)向治療，腫瘤疫苗誘導(dǎo)

2、的主動免疫等方面。隨著腫瘤免疫治療研究和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，近期人們認(rèn)識到，細(xì)菌DNA含有的或人工合成的CpG寡脫氧核苷酸(cytosine-phosphorothioate-guanine oligodeoxynucleotide，CpG ODN)，當(dāng)其和腫瘤抗原結(jié)合時，具有強(qiáng)大的免疫刺激作用；另一方面微波消融(mirowave ablation，MA)已成為原發(fā)性肝癌的重要治療手段之一，但同手術(shù)切除一樣，MA治療HCC，也存在治療

3、后復(fù)發(fā)的問題，但與手術(shù)不同的是，經(jīng)MA治療后腫瘤抗原仍存在，因此，將CpG ODN與MA結(jié)合起來，有可能提高免疫效應(yīng)，增強(qiáng)其治療肝癌的效果，本研究圍繞MA及其與CpG ODN的聯(lián)合治療肝癌進(jìn)行，旨在找到進(jìn)一步提高M(jìn)A治療肝癌效果的新途徑。 第一部分不同溫度微波消融肝癌的病理組織變化 比較HE染色和NADH．diaphorase酶組織化學(xué)染色，對判斷MA滅活肝癌組織效果的價值，揭示MA滅活肝癌的病理組織學(xué)特點(diǎn)，并確

4、定有效滅活小鼠肝癌的消融溫度，為后續(xù)研究確定消融溫度提供依據(jù)。 方法 分別用60℃，3min、55℃，3min、50℃，3min、45℃，3min不同條件的微波消融，依次治療A、B、C、D各組小鼠移植型肝癌，取微波消融前、消融后即刻及兩周時的腫瘤組織標(biāo)本制成石蠟和冰凍切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶(nicotinamide adenine dinucleotide diaphorase．NADH-di

5、aphorase)的酶組織化學(xué)染色，在顯微鏡下觀察兩種染色的情況，并觀察各組治療后的腫瘤殘余情況。 結(jié)果 從HE染色觀察，A、B、C、D各組小鼠肝癌組織在微波消融后的即刻，其細(xì)胞核形態(tài)和排列較消融前無明顯改變；酶組織化學(xué)染色顯示，A、B組腫瘤消融區(qū)內(nèi)的NADH-diaphorase的活性均消失，說明癌細(xì)胞的滅活；C、D組腫瘤消融區(qū)內(nèi)上述的酶活性呈散在陽性，提示部分癌細(xì)胞仍存活；A、B組與C、D組的腫瘤滅活效果明顯不同(P

6、<0.01)；在消融后兩周，A、B組消融腫瘤組織呈壞死干痂樣物，HE染色為無細(xì)胞結(jié)構(gòu)壞死物，酶組織化學(xué)染色顯示無NADH-diaphorase活性；C、D組有腫瘤殘留，HE染色顯示有腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)及部分壞死，酶組織化學(xué)染色提示有部分NADH-diaphorase活性；腫瘤殘余情況：A組0／8、B組1／9、C組7／9、D組8／8，A和B組與C和D組間腫瘤治愈率有顯著差別(P<0.01)。 結(jié)論 HE染色不能評價微波消融對肝癌

7、的即刻滅活效應(yīng)，用酶組織化學(xué)染色測NADH-diaphorase的酶活性能判定微波消融對肝癌的滅活效果；微波消融小鼠肝癌，對癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)有形態(tài)上“熱固定”的作用；A和B組的消融條件能有效滅活小鼠的移植型肝痛。 第二部分 單純微波消融肝癌對荷瘤鼠抗腫瘤免疫的影響 探討小鼠肝癌微波消融對宿主免疫細(xì)胞組成和細(xì)胞因子分泌的影響，以及對再次接種腫瘤的抵抗能力，初步檢測單純微波消融所產(chǎn)生的抗腫瘤免疫效應(yīng)。 方法 運(yùn)用

8、已建立C57BL／6J小鼠Hepal-6細(xì)胞移植肝癌模型，對腫瘤微波消融(MA組)或手術(shù)切除(手術(shù)組)，分別用流式細(xì)胞儀和ELISA法檢測治療前(荷瘤組)、和治療后兩周及三周宿主周圍血CD4+、CD8+、NK1.1+細(xì)胞組成(％)及血漿Th1細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IFN-γ和Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-10的水平(pg／ml)，以及治療后兩周各組再接種腫瘤的成瘤率。 結(jié)果 荷瘤組比正常組CD8+、CD4+T細(xì)胞

9、下降，NK1.1+細(xì)胞增加，細(xì)胞因子IL-2、IL-10增加，IL-4、IL-12和IFN-γ下降(均P>0.05)。MA組較荷瘤組CD8+、CD4+T細(xì)胞增加(均P>0.05)，NK1.1+細(xì)胞明顯升高(P<0.05)，IL-12、IFN-γ顯著上升(均P<0.01)，IL-4明顯降低(P<0.05)，IL-10降低(P>0.05)。手術(shù)組比荷瘤組CD8+、CD4+T細(xì)胞升高，NK1.1+細(xì)胞降低，IL-2、IL-12、IFN-γ上升

10、，IL-4和IL-10有所下降(均P>0.05)。MA組比手術(shù)組CD8+、CD4+T細(xì)胞升高(均P>0.05)，NK1.1+細(xì)胞、IL-12明顯上升(P<0.01、P<0.05)，IL-2、IFN-γ升高，IL-4、IL-10下降(均P>0.05)；再接種相同濃度腫瘤細(xì)胞時，MA組較荷瘤組成瘤率明顯降低(16.7％VS 66.7％，P<0.05)，但與手術(shù)組相比無顯著區(qū)別(16.7％VS 25％，P>0.05)。 結(jié)論

11、 MA原位滅活小鼠肝癌可促進(jìn)Th2／Th1偏移及NK細(xì)胞組成的顯著升高，但抗腫瘤再生長能力較手術(shù)組無明顯區(qū)別。 第三部分 微波消融聯(lián)合CpG ODN治療肝癌的效果 從第二部分試驗(yàn)結(jié)果可知，單純MA治療小鼠肝癌，在一定時間內(nèi)，激發(fā)的抗腫瘤免疫效應(yīng)有限，本部分實(shí)驗(yàn)利用微波消融肝癌后仍留有抗原，而CpG ODN結(jié)合腫瘤抗原可激起機(jī)體較強(qiáng)免疫效應(yīng)的特點(diǎn)，探討將二者結(jié)合起來，進(jìn)一步提高治療肝癌的效果的途徑，以減少HCC經(jīng)MA治療

12、后的殘留或復(fù)發(fā)。 方法 1．實(shí)驗(yàn)分組及處理：將荷瘤小鼠分為A(微波消融+局部注射CpG ODN)、B(單純局部注射CpG ODN)、C(單純微波消融)和D(對照)共四組，給予下面的處理即：微波消融，采用45℃，3min的消融條件消融A、C組小鼠；腫瘤局部注射CpG ODN，將CpG ODNl826和ODNl982溶于生理鹽水中，使?jié)舛葹?00μg／ml，于實(shí)驗(yàn)的0、3、6、9天，按50μg／只，給A、B組小鼠瘤周注射Cp

13、G ODN1826，給D組小鼠瘤周注射ODN1982。 2．免疫學(xué)檢測：于治療后的第12天，每組取6只小鼠，摘除眼球取血入EDTA.K2抗凝管中，流式細(xì)胞儀檢測血液中的CD4+、CD8+和NK1.1+細(xì)胞，用ELISA法檢測鼠血漿中細(xì)胞因子IL-10、IFN-γ；摘除脾臟，用MTT法測脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性；切除腫瘤組織，制做5μm冰凍切片，免疫組化法檢測腫瘤組織中浸潤的CD4+、CD8+和NKl.1+細(xì)胞，剩余鼠用于觀察治療后

14、3周時的腫瘤殘留率。 結(jié)果 A組血液中的CD4+、CD8+和NK1.1+細(xì)胞較其他組升高而明顯高于對照組(P<0.05)；A組的血漿中的細(xì)胞因子：IFN-γ濃度也顯著高于其他組(P<0.05或P<0.01)；淋巴細(xì)胞殺傷試驗(yàn)結(jié)果顯示，A組的脾淋巴細(xì)胞對靶細(xì)胞的殺傷率明顯高于其他組(P<0.05或P<0.01)；免疫組化結(jié)果標(biāo)明，A組腫瘤組織中浸潤的淋巴細(xì)胞也較其他組明顯增多(P<0.01)；治療后三周，各組腫瘤的殘留

15、情況：A組，1／9；B組，6／9；C組，9／9；D組，9／9。A組的治療效果顯著高于另外組(P<0.05或P<0.01))。 結(jié)論 微波消融聯(lián)合CpG ODN治療小鼠移植型肝癌，能夠明顯增強(qiáng)荷瘤鼠的抗腫瘤免疫，顯著提高對MA后殘余癌的殺滅，因而，可能有助于減少M(fèi)A治療肝癌后的復(fù)發(fā)。 總結(jié) 1．通過比較HE染色和NADH-diaphorase的酶組織化學(xué)染色對MA消融肝癌效果的判斷，顯示肝癌經(jīng)MA后即刻所發(fā)

16、生的主要變化不是形態(tài)學(xué)方面的，而是NADH-diaphorase活性的明顯變化，即MA滅活肝癌組織對其細(xì)胞形態(tài)具有即刻的“熱固定”作用，因此，HE染色不適合評價MA對肝癌的即刻滅活效果，采用NADH-diaphorase的酶組織化學(xué)染色能較好地顯示這種即時滅活效應(yīng)，并有助于確定有效的微波消融溫度。 2．單獨(dú)的MA激活的抗腫瘤免疫有限，MA結(jié)合CpG ODN的腫瘤局部注射，可顯著增強(qiáng)MA的免疫刺激效應(yīng)，包括全身和局部的免疫效應(yīng)，免