篩選環(huán)孢霉素A適體的Bio Mag-SELEX方法的建立.pdf

1、環(huán)孢霉素A(cyclosporinA,CsA)屬真菌來源，是含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，具有較強的細(xì)胞免疫抑制作用，能有效地防止移植后的排斥反應(yīng)，延長腎臟、肝臟、心臟等同種異體移植器官和組織的存活。同時，CsA及其代謝產(chǎn)物具有嚴(yán)重的毒副作用，主要是腎毒性和肝毒性等，故定期監(jiān)測病人血液中CsA的濃度至關(guān)重要。 SELEX技術(shù)即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化(SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialE

2、nrichment,SELEX)技術(shù)，是一種新型的體外篩選技術(shù)。適體(aptamer)，又稱適配分子或適配子，其實質(zhì)是運用SELEX技術(shù)從人工體外合成的隨機寡核苷酸序列庫中反復(fù)篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列。 適體的功能類似于抗體但明顯優(yōu)于抗體，具有靶分子范圍廣泛、親和力和特異性高、制備方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在臨床治療和診斷方法等方面都具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在運用SELEX技術(shù)從人工體外合

3、成的隨機ssDNA文庫中篩選到針對CsA的特異性適體，為建立檢測全血CsA濃度的快速而簡便的實驗室方法奠定基礎(chǔ)。 我們先將CsA共價結(jié)合到甲苯磺?；罨胖樯?。體外合成一個全長78個核苷酸中間含35個隨機序列的隨機ssDNA文庫，以連接在磁珠上的CsA為靶分子，通過BioMag-SELEX方法篩選CsA特異性適體，利用生物素-鏈親和素-辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測每輪ssDNA文庫與CsA的親和力，將最后一輪篩選產(chǎn)物克隆測序并運用相關(guān)

4、軟件進行適體序列一級結(jié)構(gòu)和二級結(jié)構(gòu)分析。 經(jīng)過10輪的篩選和擴增，得到了CsA特異性的適體，每輪ssDNA文庫與CsA的親和力呈上升趨勢。19個克隆適體序列全長78nt，根據(jù)一級結(jié)構(gòu)序列的同源性可分為5個家族，家族3有完全相同的15條適體序列，這些序列將是我們今后研究的重點。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測以莖環(huán)(發(fā)夾)結(jié)構(gòu)為主，這可能是適體與靶分子作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。CsA特異性的適體的篩選為我們今后建立相關(guān)的酶聯(lián)寡核苷酸試驗(ELOSA)等檢測方法