諾帝對實驗性糖尿病視網(wǎng)膜血管生成的影響及作用機制.pdf

1、糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabeticretinopathy,DR)的主要病理特征是微血管改變。由于氧化應(yīng)激的大量產(chǎn)生和血管生成是DR的重要的發(fā)病機制，抗氧化劑和抗血管生成在DR的治療研究中具有重要的理論價值和實踐意義。我們既往研究表明，人工合成的脂氧化酶抑制劑諾帝(Nordy)能抑制體外惡性膠質(zhì)瘤細胞生長，通過降低瘤細胞VEGF，bFGF等多種血管生成因子表達、抑制內(nèi)皮細胞遷移等方式抑制腫瘤血管生成治療惡性腫瘤。對于其在非腫瘤性血管生成性

2、疾病如DR和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用有待于進一步研究。由于DR的微血管改變主要表現(xiàn)為活躍的血管生成，而諾帝具有抗氧化和抗血管生成作用，本研究擬從體內(nèi)實驗和體外實驗兩方面檢測諾帝對DR血管生成的作用并探討其可能的作用機制。主要研究內(nèi)容和結(jié)果包括： 1.諾帝對實驗性大鼠DR治療作用的體內(nèi)實驗 采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)一次性腹腔注射誘導(dǎo)的糖尿病SpragueDawley(SD)大鼠模型，將糖尿病大鼠隨

3、機分糖尿病組(10只)、生理鹽水注射組(10只)和諾帝注射組(10只)，另取10只正常大鼠設(shè)為正常對照組。諾帝注射組腹腔注射諾帝27mg/kg體重(隔日一次)治療糖尿病大鼠，正常對照組和生理鹽水注射組采用等量生理鹽水腹腔注射替代諾帝注射，糖尿病組則不作任何處理，分別在注射后1個月和3個月取材，利用透射電鏡及體視學(xué)定量等方法觀察諾帝注射對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜毛細血管形態(tài)和毛細血管基底膜厚度的影響；采用免疫組織化學(xué)檢測了諾帝腹腔注射對糖尿病大鼠

4、視網(wǎng)膜表達血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signaltransductionandactivatorsoftranscription-3,STAT3)以及磷酸化STAT3(

5、phosphorylatedSTAT3，p-STAT3)的影響。 實驗結(jié)果顯示，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜毛細血管基底膜光滑、內(nèi)皮細胞和周細胞無明顯形態(tài)改變；這些視網(wǎng)膜幾乎不表達VEGF、iNOS、STAT3和p-STAT3，而GFAP僅限于內(nèi)界膜有微弱表達。糖尿病組和生理鹽水注射組大鼠在1個月和3個月時，毛細血管基底膜平均體積均較同期正常對照組增加(P＜0.01)。視網(wǎng)膜均能檢測到VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STA

6、T3陽性表達；在1個月和3個月，VEGF和iNOS陽性著色平均面積較同期正常對照組增加(P＜0.01)，而GFAP的陽性著色平均面積僅在3個月時較正常對照組增加(P＜0.01)，從1個月到3個月，VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STAT3的陽性著色信號均增強，到3個月時，VEGF、iNOS和GFAP陽性著色幾乎貫穿于全視網(wǎng)膜。諾帝注射組大鼠在1個月和3個月時，毛細血管基底膜平均體積較同期糖尿病組和生理鹽水注射組減少(P＜0

7、.01)；視網(wǎng)膜VEGF、iNOS、GFAP、STAT3和p-STAT3陽性表達均較同期糖尿病組和生理鹽水注射組呈不同程度的降低(P＜0.01)。 2.諾帝抑制內(nèi)皮細胞體外血管生成的觀測 利用50μg/ml糖基化牛血清白蛋白(advancedglycationbovineserumalbumin，AGE-BSA)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC)小管樣

8、結(jié)構(gòu)(tubule-likestructures，TLS)形成的體外血管生成模型，模擬糖尿病視網(wǎng)膜血管生成，用濃度為20μmol/L～200μmol/L的諾帝對這一模型進行干預(yù)處理。采用MTT(波長=570nm)比色分析和活細胞數(shù)量，用透射電鏡觀察諾帝對HUVEC形態(tài)的影響，用免疫細胞化學(xué)檢測諾帝處理24h-72h時HUVEC表達iNOS、STAT3、p-STAT3、VEGF及其受體KDR的變化，用RT-PCR方法檢測諾帝處理后HUVE

9、C的VEGF和KDR基因表達的變化，用Westernblot方法進一步檢測HUVEC表達STAT3和p-STAT3的變化。 結(jié)果顯示，25μg/ml-100μg/ml的AGE-BSA在24h-72h均能使培養(yǎng)的HUVEC數(shù)量增加，能誘導(dǎo)HUVEC在Ⅰ型膠原中形成TLS，其在Ⅰ型膠原表面形成的TLS長度較同期的無AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC顯著增加(P＜0.01)，流式細胞術(shù)檢測見AGE-BSA培養(yǎng)條件下的HUVEC的S期和G2

10、/M期細胞所占的比例和增殖指數(shù)增加；免疫細胞化學(xué)檢測這些HUVEC呈現(xiàn)iNOS、VEGF、KDR、STAT3和p-STAT3染色明顯陽性，而無AGE-BSA存在下的HUVEC僅表達KDR。ELISA檢測見AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC的上清中VEGF濃度較無AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC顯著增加(P＜0.01)。RT-PCR能檢測到AGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC有VEGF和KDR的mRNA表達。AGE-BSA的這些作用具有一定的時間和劑

11、量依賴性。采用20μmol/L-200μmol/L的諾帝處理50μg/mlAGE-BSA培養(yǎng)的HUVEC時發(fā)現(xiàn)，諾帝能抑制AGE-BSA所刺激的HUVEC增殖和S期與G2/M期細胞比例，抑制HUVEC的iNOS、VEGF、STAT3、p-STAT3和KDR的表達以及VEGF的分泌(P＜0.01)；Westernblot也證明諾帝對HUVEC的STAT3和p-STAT3表達有明顯抑制作用，但20μmol/L的諾帝處理的AGE-BSA培養(yǎng)H

12、UVEC的仍有STAT3和p-STAT3表達。 上述研究結(jié)果的主要結(jié)論如下： 1.諾帝具有抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜膠質(zhì)反應(yīng)性增生、毛細血管基底膜增厚，維持血-視網(wǎng)膜屏障功能穩(wěn)定的作用，并通過抑制VEGF和iNOS的表達而抗血管生成，從而減輕大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變。諾帝抑制STAT3/p-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能是上述作用的機制之一。 2.諾帝對AGE-BSA激活的體外內(nèi)皮細胞血管生成表型(VEGF和KDR表達及TLS