銀黃注射液和銀黃口服液在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)研究和代謝組學(xué)初步研究.pdf

1、目前中藥的作用機(jī)理研究大多照搬化學(xué)藥的研究模式，即少數(shù)有效成分的藥物動(dòng)力學(xué)研究和病理模型的藥效動(dòng)力學(xué)研究。但是既然中藥大多為復(fù)方且成分非常復(fù)雜，那么少數(shù)有效成分的藥物動(dòng)力學(xué)研究就不能代表整個(gè)中藥復(fù)方的藥動(dòng)學(xué)特征，而且這也不符合中醫(yī)的“整體論”；另外，由于中醫(yī)的證候非常復(fù)雜，很難選擇某個(gè)或某幾個(gè)相關(guān)性高、特異性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)室“金指標(biāo)”，使中藥藥效動(dòng)力學(xué)研究變得較為困難。代謝組學(xué)的興起，為中藥作用機(jī)理的研究帶來(lái)難得的機(jī)遇。代謝組學(xué)是指對(duì)生物系統(tǒng)

2、對(duì)病理生理刺激及基因改變的代謝應(yīng)答的定量分析，是一種探索機(jī)體及其共生物的整體代謝機(jī)制的方法，它主要研究藥物作用于機(jī)體后內(nèi)源性代謝物的變化，更直接地反映生化過(guò)程和狀態(tài)改變，又與中醫(yī)藥整體動(dòng)態(tài)性原則具有很大的趨同性。為了揭示中藥復(fù)方的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)研究缺陷，了解代謝組學(xué)在中藥復(fù)方作用機(jī)理研究上的優(yōu)勢(shì)和潛力，本課題選擇銀黃注射液和銀黃口服液分別進(jìn)行經(jīng)典的藥物動(dòng)力學(xué)、藥效動(dòng)力學(xué)研究和代謝組學(xué)的初步研究。 銀黃注射液和銀黃口服液由

3、金銀花提取物和黃芩提取物制備而成，具有清熱、解毒、利咽之功效，用于急性扁桃體炎、上呼吸道感染及風(fēng)熱犯肺而致發(fā)熱、咳嗽、咽痛等癥。綠原酸和黃芩苷分別是金銀花和黃芩的主要有效成分，其中綠原酸具有抗炎、保肝利膽、抗菌抗病毒等作用，黃芩苷具有抗炎、抗菌抗病毒、保護(hù)缺血再灌注損傷、保肝利膽等作用。 1 銀黃注射液和口服液體內(nèi)分析方法研究 1．1血漿中同時(shí)測(cè)定綠原酸和黃芩苷的HPLC方法研究 利用甲醇-乙腈(3:1)的混合溶

4、劑提取血漿中的綠原酸和黃芩苷；使用C<,18>色譜柱，流動(dòng)相為0.2％磷酸水溶液(A相)-甲醇/乙腈(1:1，B相)，當(dāng)B相由15％線性遞增至54％時(shí)可使兩成分得到滿意的分離；檢測(cè)波長(zhǎng)綠原酸為327nm，黃芩苷為278nm；流速為1ml·min<'-1>；葛根素和蘆丁分別作為綠原酸和黃芩苷的內(nèi)標(biāo)。綠原酸和黃芩苷的線性濃度范圍分別在0.388-12.4 μg·ml<'-1>和0.485-124μg·ml<'-1>內(nèi)其相關(guān)系數(shù)均大于0.99

5、8；綠原酸和黃芩苷的日內(nèi)、日間精密度的RSD值均分別小于7％和9％，準(zhǔn)確度RE值的范圍分別為-9.5％至3％和-4.2％至1.8％；綠原酸和黃芩苷的檢測(cè)限分別為0.194μg·ml<'-1>和0.122μg·ml<'-1>，定量限分別為0.388μg·ml<'-1>和0.485μg·ml<'-1>。 1．2尿液中毛細(xì)管區(qū)帶電泳代謝指紋圖譜分析方法研究 建立了基于毛細(xì)管區(qū)帶電泳的大鼠尿樣代謝指紋圖譜的電泳方法：選擇濃度為4

6、0mmol/L且pH值為8.2硼酸鹽緩沖溶液作為毛細(xì)管電泳的背景電解質(zhì)，電泳電壓為24kV，毛細(xì)管柱溫為25℃，進(jìn)樣量為3s×0.5psi，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nin。 所得到的二維指紋圖譜以ASCⅡ格式輸出excel數(shù)據(jù)，然后載入“計(jì)算機(jī)輔助相似性評(píng)價(jià)系統(tǒng)”，校正指紋圖譜中對(duì)應(yīng)組分色譜峰的遷移時(shí)間后，求算出各指紋圖譜全譜的相合系數(shù)(夾角余弦法)以比較各組內(nèi)指紋圖譜的相似度。對(duì)所建立的大鼠尿樣的毛細(xì)管代謝指紋圖譜方法進(jìn)行了方法學(xué)考察

7、，發(fā)現(xiàn)方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好；大鼠表現(xiàn)在尿液代謝指紋圖譜上的個(gè)體差異較小。 2 銀黃注射液和口服液的藥動(dòng)學(xué)一藥效學(xué)研究 2．1銀黃注射液和口服液的藥物動(dòng)力學(xué)研究 10只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)均分成兩組，分別單次靜注銀黃注射液0. ml·kg<'-1>和單次灌胃銀黃口服液20 ml·kg<'-1>，收集不同時(shí)間點(diǎn)的血液樣品，離心獲得血漿，用上述建立的HPLC方法分別測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的綠原酸和黃芩苷的濃度，用DA

8、S1.0藥動(dòng)學(xué)程序求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)模型擬合。結(jié)果表明大鼠單次靜注銀黃注射液后，血漿中能夠同時(shí)檢出綠原酸和黃芩苷，其中綠原酸的藥-時(shí)曲線變化呈三室開(kāi)放模型，黃芩苷的藥-時(shí)曲線變化呈二室開(kāi)放模型；大鼠單次灌胃銀黃口服液后，血漿中檢不出綠原酸，而黃芩苷的藥-時(shí)曲線呈多峰現(xiàn)象，其t<,max>分別為0.5、3、5、12 h，其絕對(duì)生物利用度為15.2％。 2．2 銀黃注射液和口服液的藥效動(dòng)力學(xué)研究 30只Wista

9、r大鼠，♀♂各半，隨機(jī)均分為口服液組、注射液組和對(duì)照組，每組10只，♀♂各半?？诜航M和注射液組連續(xù)給藥4天，每天2次，每次分別灌胃銀黃口服液1ml和靜注銀黃注射液0.2ml；對(duì)照組自由取食和飲水不做任何處理。三組每只大鼠分別在第3天以1％的角叉菜生理鹽水溶液于雙后爪足趾皮下分別注射0.1ml造炎癥模型，分別于給藥前、給藥后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量各鼠的右后爪體積，求算出腫脹率。結(jié)果表明，注射液組和口服液組的足跖腫脹率在造模后不同時(shí)間點(diǎn)均顯著地低

10、于對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明兩組均具有抗炎療效；但注射液組和口服液組相比，造模后不同時(shí)間點(diǎn)的腫脹率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.2)，說(shuō)明兩種劑型的抗炎療效相當(dāng)。 3 銀黃口注射液和口服液的代謝組學(xué)初步研究 30只Wistar大鼠，♀♂各半，隨機(jī)均分為口服液組、注射液組和對(duì)照組，單獨(dú)飼養(yǎng)于代謝籠中?？诜航M和注射液組連續(xù)給生理鹽水2天，每天兩次，每次分別灌胃生理鹽水1ml和靜注生理鹽水0.2ml；然后連續(xù)給藥4天，每天2

11、次，每次分別灌胃銀黃口服液1ml和靜注銀黃注射液0.2ml；對(duì)照組不做任何處理。三組的每只大鼠分別在第5天以1％的角叉菜生理鹽水溶液于雙后爪足趾皮下注射0.1 ml造炎癥模型。收集各鼠不同階段的尿液，用上述建立的毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法獲得了150份尿樣的代謝指紋圖譜。 對(duì)獲得的代謝指紋圖譜進(jìn)行峰平移校準(zhǔn)和數(shù)據(jù)自標(biāo)度化，主成分分析得到PCA得分總圖，圖中顯示的150個(gè)點(diǎn)除了個(gè)別游離外，基本上聚集成4大區(qū)域。對(duì)代謝指紋數(shù)據(jù)進(jìn)行分組分類(lèi)P

12、CA分析和變量權(quán)重分析，結(jié)果如下：對(duì)照組正常尿樣的晝夜和性別等生理性差異PCA分析沒(méi)有顯著性；灌胃操作的刺激所引起的代謝組的變化PCA分析沒(méi)有顯著性差異，而靜脈注射的刺激所引起的代謝組的變化PCA分析則有顯著性差異；灌胃給藥前后PCA分析沒(méi)有顯著性差異，而靜注給藥前后PCA分析有顯著性差異；灌胃給藥后和靜注給藥后的PCA分析有顯著性差異；三組造模前后PCA分析均有非常顯著的差異，變量權(quán)重分析結(jié)果表明有多個(gè)特征峰的變化非常明顯；三組造模后

13、0-36 h的組內(nèi)PCA分析均無(wú)顯著性差異；造模后0-36 h兩給藥組和對(duì)照組之間PCA分析有顯著性差異，但灌胃組和靜注組之間PCA分析則沒(méi)有顯著性差異，表明兩種給藥方式均能產(chǎn)生明顯的抗炎療效，且兩者的療效相當(dāng)。結(jié)論藥物動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，經(jīng)不同的給藥途徑后，銀黃注射液和口服液中綠原酸和黃芩苷在大鼠體內(nèi)所表現(xiàn)的藥物動(dòng)力學(xué)特征相差很大，而藥效動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果卻顯示其抗炎療效相當(dāng)，藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果和藥效動(dòng)力學(xué)結(jié)果有矛盾之處，表明用經(jīng)典的藥物動(dòng)力