靶向細胞周期蛋白D1核酶和晚期糖基化終產(chǎn)物受體siRNA抑制大鼠肝纖維化研究.pdf

1、本研究分為二部分： 第一部分：靶向細胞周期蛋白D1核酶對大鼠肝星狀細胞生物學特性的影響 目的：鑒定特異性核酶(ribzme,Rz)在體外和細胞內(nèi)對細胞周期蛋白D1(cyclin D1)mRNA的切割活性；研究特異性核酶抑制cyclin D1基因表達對活化型大鼠肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)生物學特性的影響。 方法：應用mfold軟件設(shè)計、合成針對大鼠cyclin D1 mRN

2、A不同切割位點的Rz基因,構(gòu)建核酶基因和靶基因體外轉(zhuǎn)錄載體,體外轉(zhuǎn)錄Rz基因和靶基因并進行切割實驗,放射自顯影鑒定核酶的胞外活性；構(gòu)建特異性Rz真核表達載體pLXSN-Rz,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞,用G418篩選出陽性細胞克?。环謩e應用RT-PCR和Western blotting檢測cyclin D1、α-SMA、I型膠原和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)基因的表達,鑒定核酶的胞內(nèi)活性并評價核酶對活化型HSCs生物

3、學特性的影響。 結(jié)論：Rz832在體外對靶基因有良好的切割活性；pLXSN-Rz832表達的特異性Rz在HSC-T6細胞內(nèi)也能有效地切割靶基因,明顯抑HSCs的激活。因此,cyclin D1有望成為一個潛在的抗HF基因治療的新靶點,cyclin D1特異性核酶有可能成為抑HSCs激活的有效核酸藥物。 第二部分：靶向晚期糖基化終產(chǎn)物受體siRNA抑制肝纖維化的實驗研究 目的：觀察CCl4誘導的大鼠肝纖維化(hepa

4、tic fibrosis,HF)形成過程中晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)基因表達水平的動態(tài)變化及其與HF程度的關(guān)系；研究特異性siRNA對大鼠HSC-T6細胞RAGE基因表達及其生物學特性的影響：探討RAGE特異性siRNA對CCl4誘導的大鼠HF的抑制作用及機制。 方法： 1、以50％CCl4腹腔注射制備大鼠HF模型,應用實時定

5、量PCR、Western blotting和免疫組織化學染色檢測HF不同階段肝組織RAGE、NF-κB、α-SMA、Ⅰ型膠原表達水平的變化；應用HE及天狼猩紅(Sirius red)染色對HF大鼠肝臟行組織學檢查,以Scheuer改良評分系統(tǒng)對肝臟進行炎癥活動度分級和纖維化程度分期；分別應用酶試劑法和放射免疫法檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽紅素(to

6、tal bilirubin,TBIL)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)、Ⅲ型前膠原(precollagen type Ⅲ,PCⅢ)和層粘連蛋白(laminin,LN)水平。 2、應用RNA設(shè)計軟件,設(shè)計針對RAGE mRNA 417-437、221-241和534-554位點的三對21核苷酸(nt)siRNA,合成能編碼相應特異性siRNA的寡核苷酸雙鏈R1、R2和R3;構(gòu)建RAGE特異性siRNA表達載pGC

7、si-R1、pGCsi-R2和pGCsi-R3,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HSC-T6細胞,應用實時定量PCR、Western blotting檢測特異性siRNA對HSC-T6細胞RAGE表達的沉默效率。 3、應用實時定量PCR、Western blotting分析特異性siRNA抑制RAGE對HSC-T6細胞α-SMA、NF-κB表達、合成分泌細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等生物學特性的影響。 4、

8、經(jīng)脂質(zhì)體尾靜脈注射法將pGCsi-R1轉(zhuǎn)染HF大鼠肝臟,6周后應用R1編碼的RAGE siRNA正義鏈序列特異性探針通過Northern blot分析檢測各組大鼠肝臟中RAGE siRNA的表達,應用實時定量PCR、Western blotting和免疫組化分析特異性siRNA對肝組織RAGE表達的抑制效率,應用HE染色、Sirius red染色對大鼠肝臟行組織學檢查,以Scheuer改良評分系統(tǒng)進行炎癥活動度分級和纖維化程度分期,應用

9、酶試劑法、放射免疫法、實時定量PCR、Western blotting、凝膠電泳遷移分析及免疫組織化學染色分析特異性siRNA抑制RAGE對HF大鼠血清學、肝功能、HSCs活化、肝組織ECM的合成和分泌、NF-κB基因的表達和活性及IκBα濠達的影響,應用透射電鏡觀察特異性siRNA抑制RAGE對HF大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)論： 1、RAGE在CCl4誘導的實驗性大鼠HF中的表達水平明顯上調(diào),且與HF程度、血清纖維

10、化指標、ALT和TBIL水平及NF-κB、α-SMA、I型膠原的表達水平變化呈正相關(guān),而與血清ALB水平呈負相關(guān)； 2、成功構(gòu)建RAGE特異性siRNA表達載體,pGCsi-R1表達的特異性siRNA能有效抑制HSC-T6細胞中RAGE基因的表達,其最大抑制效率為(79.65±8.88)％,有效抑制時間超過72 h； 3、RAGE特異性siRNA能明顯抑制HSCs的激活、NF-κB的表達和ECM的合成及分泌； 4