豬流感(H1N1亞型)神經(jīng)氨酸酶點(diǎn)突變拯救毒株的研究.pdf

1、豬流感(Swine Influenza，SI)是豬流感病毒感染侵入豬群中，可引起傳播流行的一種急性、熱性及高度接觸性呼吸道傳染疾病。全球范圍內(nèi)都有發(fā)生此疾病，已遍布于北美洲、亞洲、歐洲與非洲等。其危害嚴(yán)重，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并且對(duì)人類的身體健康構(gòu)成了很嚴(yán)重的威脅。2009年發(fā)生在墨西哥和美國(guó)的豬流感風(fēng)暴(Munster et al.，2009)，引起了全球?qū)I的高度重視，再次敲響了公共衛(wèi)生的警鐘。
　　 豬流感本身所具有的

2、種間傳播特異性和豬體本身作為“孵化器”“重配器”“混合器”的特異性決定了豬流感病毒的重要性和可研究性。
　　 位于流感病毒囊膜上的重要的表面糖蛋白之一神經(jīng)氨酸酶，在流感病毒出芽，子代病毒釋放與擴(kuò)散方面發(fā)揮了重要作用。在HA(血凝素)介導(dǎo)的病毒膜融合和病毒粒子感染過(guò)程中，NA(神經(jīng)氨酸酶)發(fā)揮了重要功能。有研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)氨酸酶發(fā)生突變會(huì)影響到其酶活性，進(jìn)而影響病毒粒子的毒力?；谝陨蠋c(diǎn)開(kāi)展一系列的研究，主要研究?jī)?nèi)容如下：

3、　　 1.實(shí)驗(yàn)研究毒株的確立和細(xì)胞適應(yīng)株的建立
　　 本研究選用的毒株是H1N1亞型豬流感病毒A/Swine/Tianjin/01/2004(H1N1)(以下簡(jiǎn)稱TJ)，本毒株是2004年由實(shí)驗(yàn)室人員分離得到。通過(guò)對(duì)它的一些基本研究發(fā)現(xiàn)，TJ毒株在細(xì)胞上的適應(yīng)能力很差?；诖耍ㄟ^(guò)對(duì)其在細(xì)胞上連續(xù)傳代增殖，發(fā)現(xiàn)在傳代3次后能夠達(dá)到一個(gè)很穩(wěn)定的血凝價(jià)水平，達(dá)到29。比原毒株相比，血凝價(jià)略微升高。將TJ毒株在細(xì)胞上適應(yīng)后建立的適應(yīng)

4、株稱為TJ細(xì)胞適應(yīng)株。
　　 2.點(diǎn)突變感染性克隆的構(gòu)建
　　 將TJ原毒株和細(xì)胞適應(yīng)株八個(gè)基因通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)氨酸酶片段中有兩個(gè)位點(diǎn)發(fā)生的突變(658和1254)，基于此構(gòu)建了點(diǎn)突變的神經(jīng)氨酸酶雙向表達(dá)載體質(zhì)粒。通過(guò)利用成熟的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)，拯救出點(diǎn)突變病毒毒株，分別命名為TJNA658和TJNA1254。
　　 3.拯救毒株的毒力相關(guān)性研究
　　 首先，對(duì)拯救毒株做基本測(cè)定，發(fā)現(xiàn)TJNA125

5、4拯救毒株比原毒株相比，表現(xiàn)出血凝價(jià)升高4倍，EID50增強(qiáng)，本研究還對(duì)拯救毒株進(jìn)行雞胚和BALB/c小鼠動(dòng)物模型試驗(yàn)。結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：與原毒株相比，TJNA1254和TJNA658毒株的毒力明顯增強(qiáng)，而且TJNA1254毒力增強(qiáng)的相對(duì)更明顯些。同時(shí)還開(kāi)展了檢測(cè)攻毒小鼠肺組織中的細(xì)胞因子變化的相關(guān)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)拯救毒株刺激細(xì)胞因子表現(xiàn)出增強(qiáng)趨勢(shì)。最后，通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)氨酸酶的相對(duì)活性，結(jié)果顯示：點(diǎn)突變的神經(jīng)氨酸酶基因蛋白的活性比原毒株的神經(jīng)氨酸