前列腺素E-,2-對大鼠成骨細胞OCIL基因表達的調(diào)節(jié)及其分子機制的研究.pdf

1、前列腺素E<,2>(PGE<,2>)是一種多功能的骨代謝調(diào)節(jié)因子，PGE<,2>通過其不同的受體介導(dǎo)的信號傳遞途徑對成骨細胞和破骨細胞的分化及其功能發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。破骨細胞抑制性凝集素(OCIL)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種重要的破骨細胞抑制因子。大鼠OCIL是一種由233個氨基酸組成的Ⅱ型跨膜C型凝集素，其組織分布與RANKAL非常相似。OCIL 主要由骨組織中的成骨細胞和軟骨細胞合成，主要作用是抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細胞生成。最近有

2、研究發(fā)現(xiàn)，PGE<,2>刺激原代培養(yǎng)的小鼠成骨細胞OCIL基因表達，提示OCIL可能參與了PGE<,2>對骨代謝的調(diào)節(jié)過程，但PGE<,2>調(diào)節(jié)OCIL基因表達的信號通路和具體的分子機制國內(nèi)外均未見報道。為此，我們初步探討了PGE<,2>對大鼠成骨細胞OCIL基因表達的調(diào)節(jié)作用及其信號通路。為深入研究PGE<,2>對OCIL基因表達的調(diào)控機制，我們首次成功克隆了大鼠OCIL基因啟動子并構(gòu)建了系列啟動子熒光素酶報告基因載體，初步研究了PG

3、E<,2>對OCIL，基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，為今后進一步鑒定出OCIL，基因啟動子中PGE<,2>調(diào)控OCIL基因表達的功能性元件奠定了基礎(chǔ)。 在第一部分，我們首先研究了PGE<,2>對原代培養(yǎng)的大鼠成骨細胞OCILmRNA表達水平的影響，發(fā)現(xiàn)PGE<,2>明顯上調(diào)OCIL mRNA表達。為確定。PGE<,2>對OCILmRNA表達的調(diào)節(jié)是否存在時間效應(yīng)和劑量依賴關(guān)系，我們將大鼠UMR106 成骨細胞用不同劑量的PGE<,2

4、>(0.01nM～1μM)處理不同時間(0、2h、4h、6h、12h和24h)后，采用實時熒光PCR檢測細胞OCIL mRNA的表達水平。結(jié)果表明：PGE<,2>對OCIL mRNA表達的調(diào)節(jié)存在明顯的時間效應(yīng)和劑量依賴關(guān)系，PGE<,2>在其劑量為0.1μM、處理細胞6小時后對OCIL mRNA表達的上調(diào)幅度最大。 為進一步明確何種信號通路介導(dǎo)了PGE<,2>誘導(dǎo)的大鼠成骨細胞OCIL基因表達，我們采用不同信號通路的激動劑和阻

5、斷劑處理細胞，然后采用實時熒光定量PCR檢測OCIL mRNA表達水平。結(jié)果表明：PKA激動劑FSK和db-cAMP明顯促進OCIL mRNA表達，而PKA抑制劑KT-5720則下調(diào)PGE<,2>刺激的OCIL mRNA表達，水平下降約56％(p<0.01)。鈣離子載體A23187明顯上調(diào)OCIL mRNA表達，而鈣通道阻斷劑維拉帕米則下調(diào)PGE<,2>2刺激的OCIL mRNA表達，水平下降約40％(p<0.05)，鈣調(diào)蛋白抑制劑W7

6、也顯著下調(diào)PGE<,2>刺激的OCIL mRNA表達，水平下降約60％(p<0.01)。ERK特異性阻斷劑PD98059明顯下調(diào)PGE<,2>刺激的OCIL mRNA表達，水平下降約65％(p<0.01)。PKC激動劑PMA顯著抑制OCIL，mRNA表達，而其阻斷劑chelerythrine則明顯上調(diào)PGE<,2>誘導(dǎo)的OCILmRNA 的表達水平。以上研究結(jié)果表明：PKA、MAPK途徑和鈣信號途徑介導(dǎo)了PGE<,2>誘導(dǎo)的大鼠UMR1

7、06 成骨細胞OCIL基因的表達。 在第二部分，為深入研究PGE<,2>調(diào)節(jié)OCIL基因表達的分子機制，我們構(gòu)建了大鼠OCIL基因5′側(cè)翼區(qū)(-2805～+118bp) DNA 片段熒光素酶報告基因表達載體并將其轉(zhuǎn)染入UMR106成骨細胞，證實其具有啟動子轉(zhuǎn)錄活性。進一步研究表明：PGE<,2>顯著促進OCIL基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，表明PGE<,2>至少在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)大鼠OCIL基因表達。在此基礎(chǔ)上我們構(gòu)建了系列大鼠OCIL啟