脂多糖、前列腺素E-,2-在骨再生中的作用.pdf

1、研究背景:骨再生是由成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和其他多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的復(fù)雜的修復(fù)過(guò)程,其核心是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成的一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。骨折后的愈合和貫穿人一生的骨代謝都是靠骨再生過(guò)程來(lái)完成的。然而,中年后隨著年齡增長(zhǎng)由于骨吸收速度大于骨形成速度所造成的骨質(zhì)疏松、以及由于骨形成停滯造成的骨折后延遲愈合甚至骨不連等疾病一直是困擾醫(yī)務(wù)工作者的難題。近年來(lái),參與及調(diào)控骨再生過(guò)程中的細(xì)胞因子已成為人們研究的熱點(diǎn),而作為激發(fā)骨折

2、愈合起始階段并起著重要作用的促炎癥因子在骨再生中的作用機(jī)理還未被很好地闡明。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)都是骨再生過(guò)程中重要的促炎癥因子。
　　 LPS,可誘導(dǎo)多種炎癥因子的釋放。LPS對(duì)細(xì)胞及組織的作用被喻為“雙刃劍”。早期的研究表明LPS能直接導(dǎo)致細(xì)胞及組織的凋亡或壞死,而最新的研究發(fā)現(xiàn)低濃度的LPS又可促進(jìn)細(xì)胞或組織的增殖。而低濃度的LP

3、S是否能促使成骨細(xì)胞增殖還鮮有報(bào)道。PGE2,一直是研究骨再生過(guò)程中的熱點(diǎn),內(nèi)源性和外源性的PGE2、體外和體內(nèi)PGE2在骨再生過(guò)程中的作用各不相同。PGE2促進(jìn)骨吸收的作用研究已相對(duì)成熟,而其在成骨方面的作用機(jī)制還未被闡明。NF-κB,是廣泛存在于胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,通常以p65-p50二聚體的形式存在,在LPS等外界因素刺激成骨細(xì)胞分泌PGE2的同時(shí),往往伴隨著NF-κB的活化,而抑制其活化可阻礙由于雌激素缺乏造成的骨丟失。

4、本課題將研究LPS、PGE2和NF-κB在成骨細(xì)胞增殖和分化以及在體內(nèi)骨折愈合中的相互作用。
　　 目的:探討LPS和PGE2兩種促炎癥因子在骨再生過(guò)程中的作用及信號(hào)途徑,試圖找到一個(gè)關(guān)鍵性的靶點(diǎn),為以后基因治療骨不連、骨延遲愈合等疾病提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。
　　 方法:
　　 1.采用500 ng/mL的LPS、500 ng/mL的LPS和COX-2抑制劑sc791、500ng/mL的LPS和NF-κB抑制劑BAY

5、11-7082分別處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞1h、6h和12h。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期,利用RT-PCR和westernblot法檢測(cè)和比較LPS對(duì)成骨細(xì)胞NF-κB mRNA和蛋白水平的變化,采用western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB、COX-2蛋白表達(dá)的變化,利用免疫熒光和EMSA法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB蛋白核轉(zhuǎn)移情況和活力的變化情況。
　　 2.采用10 μmol/L PGE2、5 μmol/L

6、BAY 11-7082和10 μmol/L PGE2分別處理MC3T3-E1成骨細(xì)胞30 min,2 h和4 h。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力,利用流式細(xì)胞檢測(cè)法檢測(cè)各組的細(xì)胞周期和凋亡率變化,通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞ALP活力了解細(xì)胞的分化情況,采用western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB、BMP-7和Id2蛋白的表達(dá)、利用免疫熒光和EMSA法檢測(cè)各組細(xì)胞NF-κB蛋白的核轉(zhuǎn)移和活力變化。
　　 3.采用wistar大鼠造橈骨骨折

7、模型,用BAY11-7082進(jìn)行局部骨折部位注射干預(yù),分別于3d,7d,14d和28d取出骨痂組織,檢測(cè)骨痂組織ALP活力了解其成骨情況,采用elisa法檢測(cè)骨痂組織PGE2含量,利用western blot法檢測(cè)骨痂組織中NF-κB、BMP-7和Id2蛋白的表達(dá)情況,利用組織切片HE染色法觀察14d和28d時(shí)處理組和非處理組骨痂組織結(jié)構(gòu)。
　　 4.10 μmol/L PGE2處理細(xì)胞30 min后,收集正常對(duì)照組和處理組的細(xì)

8、胞,用。TRIZOL 冰上懸浮后立即轉(zhuǎn)交至上海生物芯片公司做RNA的提取、RNA的檢測(cè)和基因芯片的雜交。本課題采用的基因芯片為美國(guó)西北大學(xué)基因芯片中心實(shí)驗(yàn)室制備的人類全基因組芯片,芯片包含34995個(gè)基因探針點(diǎn)。芯片結(jié)果采用Agilent掃描儀進(jìn)行掃描,Feature extraction軟件讀取數(shù)據(jù)后進(jìn)行Normalize處理分析。將Ratio≥2或≤0.5,p Value Log Ratio＜0.01作為表達(dá)差異顯著的基因。

9、　　 結(jié)果:
　　 1.500 ng/mL LPS處理細(xì)胞6 h、12 h后,細(xì)胞的增殖指數(shù)有顯著性增高(P<0.01),COX-2抑制劑sc791不能抑制由LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖,NF-κB抑制劑BAY 11-7082可顯著抑制由LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖。LPS處理成骨細(xì)胞6 h后,NF-κB的mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05),蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比有顯著的增高(P<0.01),說(shuō)明LPS作用在成骨細(xì)胞

10、NF-κB的蛋白水平,而不是在mRNA水平。LPS處理成骨細(xì)胞后NF-κB發(fā)生核易位和活力的增強(qiáng),而COX-2蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著變化(P>0.05),sc791 并不能抑制由LPS誘導(dǎo)的NF-κB活力增強(qiáng),說(shuō)明低濃度的LPS是通過(guò)非COX-2依賴的NF-κB途徑誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖的。
　　 2.10 μmol/L PGE2處理成骨細(xì)胞2h和4h時(shí),細(xì)胞增殖活力與對(duì)照組比較有顯著下降(P<0.01),而細(xì)胞的ALP活力較正

11、常組顯著增加(P<0.01),說(shuō)明PGE2可抑制成骨細(xì)胞增殖,促進(jìn)其分化。PGE2處理成骨細(xì)胞30 min時(shí)細(xì)胞的NF-κB和BMP-7蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較即顯著增加(P<0.01),Id2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較顯著下降(P<0.01),細(xì)胞內(nèi)NF-κB蛋白出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移和活力增加,說(shuō)明PGE2可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化,BMP-7蛋白的表達(dá)增強(qiáng),Id2蛋白表達(dá)下降。PGE2單獨(dú)處理成骨細(xì)胞時(shí)細(xì)胞的凋亡率與正常組比較無(wú)顯著差異(P>0.

12、05),BAY11-7082和PGE2共同處理細(xì)胞后,細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率與正常對(duì)照組比較都有顯著增高(P<0.01),且NF-κB、BMP-7蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較顯著下降(P<0.01),Id2蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較顯著增加(P<0.01),ALP活力較對(duì)照組顯著下降(P<0.01),說(shuō)明NF-κB抑制劑可顯著抑制由PGE2誘導(dǎo)的細(xì)胞分化,與PGE2共同作用可引起細(xì)胞凋亡,并可顯著抑制由PGE2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞內(nèi)BMP-7和Id2

13、蛋白表達(dá)的變化。
　　 3.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中骨折未處理組3 d和7 d時(shí)骨痂組織的PGE2含量和ALP活力都較對(duì)照組顯著增加(P<0.01),NF-κB、BMP-7蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.01),Id2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著下降(P<0.01),說(shuō)明在正常骨折愈合過(guò)程中,PGE2含量和ALP活力增高,NF-κB、BMP-7蛋白表達(dá)升高,Id2蛋白表達(dá)下降。用BAY11-7082干預(yù)后,骨痂的PGE2含量和ALP活力都較對(duì)照組顯

14、著下降(P<0.01)。NF-κB、BMP-7蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著下降(P<0.01),Id2蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加(P<0.01)。組織學(xué)切片HE染色可見BAY11-7082處理組術(shù)后14d時(shí)骨痂組織為軟骨性骨痂,而骨折未處理組術(shù)后14d時(shí)骨痂組織的邊緣處已經(jīng)形成骨性骨痂,BAY11-7082處理組28d時(shí)骨痂組織中開始出現(xiàn)骨性骨痂,而骨折未處理組28 d時(shí)骨痂組織中均為骨性骨痂。表明BAY11-7082可抑制體內(nèi)骨折愈合過(guò)程中PG

15、E2含量和ALP的活力,最終導(dǎo)致骨折延遲愈合。
　　 4.PGE2處理30 min后,成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜中有276個(gè)基因表達(dá)上調(diào),168個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。與炎癥、骨再生有關(guān)的PGE2誘導(dǎo)的上調(diào)基因有:monocyteto macrophage differentiation-associated(MMD)基因,即單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化基因；nuclear receptor subfamily 4,group A,member 2基

16、因,即NR4A2,NF-κB的活化是和NR4A2的啟動(dòng)子密切相聯(lián)的,且NF-κB和NR4A2密切相連的位點(diǎn)正是p65-p50異源二聚體或p50同源二聚體；catenin(cadherin-associated protein),即鈣粘蛋白,Wnt/β-catenin通路通常被稱為Wnt通路,在骨再生過(guò)程中起重要作用；osteoblast specific factor(POSTN),即成骨細(xì)胞特異性因子；bonemorphogeneti

17、c protein 7(osteogenic protein 1),即BMP-7。與炎癥、骨再生有關(guān)的PGE2誘導(dǎo)的上調(diào)基因有:Id1、Id2、Id3。
　　 結(jié)論:
　　 1.低濃度的LPS可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖。LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖作用是通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑,而與COX-2的蛋白表達(dá)無(wú)關(guān)。我們推測(cè)在骨再生炎癥反應(yīng)的初始階段,NF-κB信號(hào)途徑起核心作用。
　　 2.PGE2可通過(guò)NF-κB信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)BM

18、P-7蛋白的高表達(dá)和Id2蛋白表達(dá)下降,從而引起成骨細(xì)胞分化,促進(jìn)骨形成。BAY11-7082可抑制PGE2對(duì)成骨細(xì)胞的分化作用,共同作用于成骨細(xì)胞可引起細(xì)胞凋亡。NF-κB可調(diào)節(jié)骨折愈合過(guò)程中PGE2的產(chǎn)量。BAY11-7082可抑制骨折愈合過(guò)程中PGE2產(chǎn)量的增加,降低ALP活力,最終導(dǎo)致骨折延遲愈合。PGE2-NF-κB的相互調(diào)節(jié)作用在骨再生過(guò)程中是非常重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
　　 3.應(yīng)用基因芯片技術(shù)研究PGE2對(duì)成骨細(xì)胞