基質(zhì)金屬蛋白酶-2和-9對(duì)惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲作用的影響.pdf

1、前言與目的： 惡性膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，腫瘤細(xì)胞迅速增殖、高度侵襲以及新生血管生成是膠質(zhì)瘤的基本特征。其中，腫瘤細(xì)胞高度侵襲是膠質(zhì)瘤高死亡率的主要原因，同時(shí)也是膠質(zhì)瘤的典型的生物學(xué)標(biāo)志。膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的過(guò)程主要包括腫瘤細(xì)胞粘附到細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)，ECM成分的降解，以及隨后的腫瘤細(xì)胞穿透進(jìn)入鄰近的腦組織。圍繞著腫瘤侵襲機(jī)制的研究一直以來(lái)就是膠質(zhì)瘤研究的重點(diǎn)。目前觀

2、點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)如基質(zhì)金屬蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases，MMPs)等參與了ECM的降解過(guò)程。MMPs是鋅離子依賴的限制性內(nèi)切酶，MMPs家族在各種生理病理?xiàng)l件下的ECM的降解過(guò)程中均發(fā)揮了重要的作用。許多研究表明MMPs能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲入正常組織和促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，MMPs表達(dá)水平與惡性膠質(zhì)瘤的侵襲程度密切相關(guān)。其中，由于明膠酶(MMP—2，MMP—9)能夠裂解Ⅳ型膠原—構(gòu)成基底膜的主要成

3、分，因此其在膠質(zhì)瘤侵襲機(jī)制中的作用研究日益成為研究的熱點(diǎn)。 越來(lái)越多的證據(jù)表明，在膠質(zhì)瘤內(nèi)部存在著一組具有干細(xì)胞特性的小的細(xì)胞集群—腫瘤干細(xì)胞(Cancer Stem Cells，CSCs)，膠質(zhì)瘤CSCs具有自我更新、多向分化以及體內(nèi)成瘤的能力，可以分化成多種細(xì)胞成分，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并且與腫瘤的化療耐藥性及放療抗性密切相關(guān)，因此在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了決定性的作用。但是就膠質(zhì)瘤CSCs本身的侵襲特性的研究尚未見

4、報(bào)道。本研究中我們成功分離并鑒定多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme，GBM)細(xì)胞系U87、9L、原代培養(yǎng)細(xì)胞系GBM1的CSCs；探討膠質(zhì)瘤CSCs與非腫瘤干細(xì)胞(non—CSCs)的侵襲情況，明確兩種細(xì)胞亞群的侵襲能力的差異；以及MMP—2、MMP—9表達(dá)在GBM的CSCs侵襲機(jī)制中的作用，為以CSCs為靶點(diǎn)的膠質(zhì)瘤治療方案的篩選提供有力的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1實(shí)驗(yàn)材料 腫

5、瘤組織取自洛杉磯Cedars—Sinai醫(yī)學(xué)中心神經(jīng)外科手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)病理診斷證實(shí)為GBM。GBM細(xì)胞系U87、9L細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC(American Tumor Cell Collection)。DMEM/F12培養(yǎng)液、B27(一種干細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑)購(gòu)自Invitrogen公司，肝素(Heparin)購(gòu)自Sigma公司，人表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor，EGF)和堿性成纖維生長(zhǎng)因子(basic Fib

6、roblast Growth Factor，bFGF)購(gòu)自R＆D Systems公司。盒式載玻片(Chamber Slides)購(gòu)自Electron Microscopy Sciences公司。免疫熒光抗體采用：小鼠抗人CD133單抗(1:10，Milteny Biotec)，小鼠抗人nestin單抗，小鼠抗人β-TubulinⅢ單抗(1：200，Chemicon)，兔抗人GFAP多抗，小鼠抗人myelin/oligodendrocyt

7、e單抗(1:1000，Chemicon)，Cy3標(biāo)記的兔抗小鼠或山羊抗兔二抗(1：200，Jackson Immuno Reserech)。細(xì)胞侵襲分析試劑盒(ECM550，聚碳酸酯膜，8—μm孔徑)購(gòu)自Chemicon公司(Temecula，CA)。免疫組織化學(xué)染色采用：小鼠抗入MMP—2和MMP—9單克隆抗體購(gòu)自Calbiochem公司(San Diego，CA)。6—8周齡的免疫缺陷裸鼠、成年雄性F344大鼠(重量200g～220

8、g)，由洛杉磯Cedars—Sinai醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 2實(shí)驗(yàn)方法 2.1 CSCs培養(yǎng)分離：腫瘤標(biāo)本經(jīng)清洗、剪碎、胰酶消化，濾網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞。淋巴細(xì)胞分離液除去其中的紅細(xì)胞，U87、9L細(xì)胞系細(xì)胞先用含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)擴(kuò)增，后轉(zhuǎn)至含EGF和bFGF的無(wú)血清培養(yǎng)液(DMEM/F12)培養(yǎng)，形成細(xì)胞球。 2.2有限稀釋法：收集細(xì)胞球

9、細(xì)胞稀釋后培養(yǎng)觀察單細(xì)胞克隆能力，檢測(cè)細(xì)胞球細(xì)胞的自我更新能力。細(xì)胞球再經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞，于盒式載玻片中應(yīng)用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，觀察細(xì)胞球細(xì)胞的多向分化情況。 2.3免疫熒光染色：細(xì)胞球細(xì)胞及分化的腫瘤細(xì)胞固定后，分別滴加干細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物，Cy3標(biāo)記二抗，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞分化情況。 2.4細(xì)胞顱內(nèi)種植：應(yīng)用Stoeling腦立體定向注射儀，將50，000個(gè)細(xì)胞球細(xì)胞或非細(xì)胞球細(xì)胞定向注入裸鼠右側(cè)紋狀體。21

10、天后處死裸鼠，取腦組織觀察評(píng)價(jià)不同亞群腫瘤細(xì)胞的顱內(nèi)成瘤能力。 2.5體外細(xì)胞侵襲能力的測(cè)定：分別收集細(xì)胞球細(xì)胞和非細(xì)胞球細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞侵襲分析試劑盒，計(jì)數(shù)侵襲到濾膜背面的穿膜細(xì)胞數(shù)，以穿膜細(xì)胞的數(shù)目表示細(xì)胞侵襲力的大小。 2.6 H&E染色：如上述方法進(jìn)行顱內(nèi)種植，分別于接種后不同時(shí)間點(diǎn)14天、21天、28天處死裸鼠，制作16—μm腦組織冰凍切片，觀察顱內(nèi)新生腫瘤的浸潤(rùn)和侵襲性生長(zhǎng)情況。 2.7免疫組織化學(xué)：冰

11、凍切片，應(yīng)用MMP—2、MMP—9抗體，采用SABC法檢測(cè)MMP—2、 MMP—9在裸鼠腦組織內(nèi)的表達(dá)情況。 2.8實(shí)時(shí)定量RT-PCR：采用RNeasy試劑盒(QIAGEN)分別提取細(xì)胞及組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，應(yīng)用Icycler PCR儀(BIO—RAD，Hercules，CA)行PCR反應(yīng)。相對(duì)mRNA表達(dá)水平對(duì)比兩種細(xì)胞亞群的基因表達(dá)差異，以及新生腦腫瘤組織中的MMP—2和MMP—9的表達(dá)差異。 2.

12、9 Western blot檢測(cè)：提取細(xì)胞及組織的總蛋白，紫外分光光度法蛋白定量。4—20％ Tris—甘氨酸SDS-PAGE膠中(Invitrogen)電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，分別加入MMP—2和MMP—9一抗，后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，顯色系統(tǒng)顯色。β—actin為內(nèi)參照。 2.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0軟件。采用雙尾Student's t檢驗(yàn)，數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

13、 結(jié)論： 1 GBM細(xì)胞球細(xì)胞具有CSCs的特性，具有自我更新、多向分化以及體內(nèi)成瘤的能力可以作為理想的CSCs進(jìn)行深入研究。 2在體內(nèi)及體外條件下，膠質(zhì)瘤CSCs表現(xiàn)出較non—CSCs明顯增強(qiáng)的侵襲能力。膠質(zhì)瘤CSCs極大地促進(jìn)了腫瘤的侵襲能力，至少部分是因?yàn)槟z質(zhì)瘤CSCs同時(shí)擁有了腫瘤細(xì)胞和NSCs的特性，它們?cè)谀z質(zhì)瘤的成瘤過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，膠質(zhì)瘤CSCs也許是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲從而促進(jìn)腫瘤的形成