乙肝患者肝移植術(shù)中紅細(xì)胞回收與病毒滅活后紅細(xì)胞功能的研究.pdf

1、乙型肝炎是人類面對(duì)的最常見的疾病之一，已成為僅次于心腦血管病和惡性腫瘤的重大疾病，對(duì)人類危害極大。肝移植是治療終末期乙肝患者的最有效手段。肝移植手術(shù)創(chuàng)傷大，技術(shù)復(fù)雜，手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)，加之患者凝血功能低下，術(shù)中出血量大，圍術(shù)期需要輸注大量異體血。這與血源供應(yīng)不足，臨床用血緊張相矛盾，對(duì)血源的供應(yīng)將是一個(gè)重大的挑戰(zhàn)。如果不能很好的解決這一問(wèn)題，將在一定程度上限制肝移植的發(fā)展。自體血回收能即刻提供完全相容、常溫的同型血液，能避免異體輸血傳播血源性

2、疾病的危險(xiǎn)，幾乎杜絕了異體輸血后出現(xiàn)的發(fā)熱反應(yīng)、過(guò)敏反應(yīng)、溶血反應(yīng)和移植物抗宿主病等不良反應(yīng)。 肝移植術(shù)后肝炎復(fù)發(fā)是影響此類患者肝移植成功的重要因素。回收的自體血經(jīng)過(guò)病毒滅活處理后再回輸，盡可能減少患者血液循環(huán)中乙肝病毒滴度，則有可能給降低肝移植術(shù)后肝炎復(fù)發(fā)創(chuàng)造良好條件，提高肝移植的成功率。目前，在臨床上洗滌回收式自體輸血占主流，將術(shù)野的出血經(jīng)過(guò)收集、過(guò)濾、加工后作為洗滌紅細(xì)胞回輸，能回收患者失血量約90％的紅細(xì)胞，回收血中紅細(xì)

3、胞濃度較高(Hct≥50％)，并清除了創(chuàng)面的組織碎片、游離血紅蛋白、激活凝血因子、術(shù)野混進(jìn)的脂肪細(xì)胞及抗凝劑等，避免了非洗滌式回收的嚴(yán)重并發(fā)癥。光化學(xué)滅活法能有效地滅活血液制品中人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等病原體。所用的光敏劑包括亞甲藍(lán)(MB)和核黃素(RF)等。光化學(xué)法的原理是利用血液有效成分中不含核酸，而光敏劑在特定 光線作用下能介導(dǎo)核酸骨架鏈斷裂，達(dá)到徹底滅活病毒的目的。在乙肝肝移植術(shù)中使用自體血液回收與

4、病毒滅活后回輸技術(shù)，將為肝移植圍術(shù)期的臨床輸血提供一種嶄新的思路：既達(dá)到節(jié)約大量血液，緩解目前普遍存在的用血緊張的狀況；又能使肝移植患者盡量避免輸注異體血，減少輸血不良反應(yīng)，為術(shù)后恢復(fù)創(chuàng)造良好條件;同時(shí)減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，具有廣闊的應(yīng)用前景。 研究目的： 1、研究乙肝患者肝移植術(shù)中自體血液回收對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理功能的影響。 2、使用亞甲藍(lán)光化學(xué)法(MBP)及核黃素光化學(xué)法(RFP)對(duì)乙肝病毒進(jìn)行滅活，評(píng)價(jià)

5、兩種方法對(duì)乙肝病毒的滅活效果。 3、研究亞甲藍(lán)光化學(xué)法及核黃素光化學(xué)法對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理功能的影響，確定可供臨床使用的乙肝病毒滅活方法。 材料與方法： 1、材料 1.1標(biāo)本來(lái)源 乙肝肝移植病人術(shù)前靜脈血及術(shù)中回收血標(biāo)本(15例)，高滴度乙肝病毒病人靜脈血標(biāo)本(15例)。 1.2材料 DNA提取試劑盒、HBV DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、核黃素、亞甲藍(lán)、FITC標(biāo)記兔抗鼠

6、IgG(H+L)、抗HBV Pre-S抗原鼠單克隆抗體、DNA凝膠回收試劑盒、2，3-DPG測(cè)定試劑盒、超微量ATP酶測(cè)試盒、丙二醛測(cè)定試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒、游離血紅蛋白測(cè)試盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)、Premix Taq酶、瓊脂糖、高氯酸、30％Acr(丙烯酰胺)單體貯液、1.5M Tris-HCl(PH8.8)、0.5M Tris—HCl(PH6.8)、10％SDS、1096過(guò)硫酸銨、染色液、脫色液、丙二醛固

7、定液、DNA mark、溴化乙錠等。 2、方法 2.1隨機(jī)選擇行乙肝肝移植患者，行氣管內(nèi)全麻，維持適宜的麻醉深度，收集術(shù)前靜脈血及術(shù)中回收血標(biāo)本(以下簡(jiǎn)稱回收前后血標(biāo)本)，檢測(cè)紅細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與生理功能。 2.1.1紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè) 應(yīng)用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV，在倒置顯微鏡下行紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)分，掃描電鏡下觀察紅細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)，采用SDS-PAG

8、E對(duì)紅細(xì)胞膜骨架蛋白進(jìn)行分析。 2.1.2紅細(xì)胞生理功能檢測(cè) 按照試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)回收前后紅細(xì)胞2，3-DPG濃度，血漿游離血紅蛋白(FHb)含量，紅細(xì)胞膜Na+一K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶活性，丙二醛(MDA)含量，采用氯化鈉磷酸緩沖液梯度稀釋法檢測(cè)紅細(xì)胞滲透脆性。 2.1.3血液流變學(xué)檢測(cè) 用流變儀檢測(cè)各樣本流變學(xué)指標(biāo)：全血低、中、高切粘度，血漿粘度，血液相對(duì)粘度，紅細(xì)胞

9、聚集指數(shù)，卡松粘度及屈服應(yīng)力。 2.2隨機(jī)抽取高滴度乙肝病毒病人靜脈血標(biāo)本，用亞甲藍(lán)光化學(xué)法及核黃素光化學(xué)法對(duì)乙肝病毒進(jìn)行滅活，評(píng)價(jià)兩種方法對(duì)乙肝病毒的滅活效果。 2.2.1亞甲藍(lán)光化學(xué)法：分別以5、20、40、80μmol/L的終濃度，可見冷光3.5萬(wàn)～4萬(wàn)1ux的強(qiáng)度照射30分鐘、1小時(shí)和1.5小時(shí)。 2.2.2核黃素光化學(xué)法：分別以50、200、400、1200，1600 μmol/L的終濃度，UVA 20

10、焦耳/cm2的強(qiáng)度照射30分鐘、1.5小時(shí)和2小時(shí)。 2.2.3按試劑盒說(shuō)明書提取滅活前后全血標(biāo)本DNA，以乙肝病毒C基因?yàn)槟康幕蛟O(shè)計(jì)引物，在到達(dá)平臺(tái)期前結(jié)束PCR反應(yīng)，對(duì)C基因表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。 2.2.4按試劑盒說(shuō)明書操作，采用特異性探針實(shí)時(shí)熒光定量PER(RT-PCR)檢測(cè)全血標(biāo)本中HBV DNA拷貝數(shù)。 2.3采用流氏細(xì)胞術(shù)，以抗HBV Pre-S抗原鼠單克隆抗體為一抗，以FITC標(biāo)記兔抗鼠IgG為二抗

11、，檢測(cè)乙肝病人紅細(xì)胞表面乙肝病毒的表達(dá)情況。 2.4對(duì)病毒滅活前后血標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)與生理功能檢測(cè)，確定可供臨床使用的乙肝病毒滅活方法(具體方法同上述2.1) 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用χ-±s表示，標(biāo)本處理前后各指標(biāo)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 一、紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果 1、乙肝肝移植術(shù)中血液回收前后紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)

12、觀察 紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)分有增多的趨勢(shì)，但仍在正常范圍內(nèi)，回收前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 2、乙肝病毒滅活前后紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 病毒滅活前后紅細(xì)胞形態(tài)學(xué)計(jì)分、MCV、MCH、MCHC、RDW-SD及RDW-CV均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 3、掃描電鏡下觀察紅細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 回收血液中偶爾出現(xiàn)不規(guī)則棘形紅細(xì)胞;核黃素光化學(xué)法滅活后偶爾出現(xiàn)異常突起紅細(xì)胞;而亞

13、甲藍(lán)光化學(xué)法滅活后，偶爾出現(xiàn)皺褶紅細(xì)胞。 4、SDS-PAGE分析紅細(xì)胞膜骨架蛋白 帶3蛋白及其他蛋白與帶3蛋白的比例在自體血液回收前后及病毒滅活前后無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。 二、紅細(xì)胞生理功能檢測(cè)結(jié)果 術(shù)野回收血比起術(shù)前靜脈血，F(xiàn)Hb明顯增高(P<0.05)，2，3-DPG、Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、MDA和滲透脆性均無(wú)明顯變化(P>0.05)。 核黃素光化

14、學(xué)法滅活后比起滅活前靜脈血，Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase明顯降低，MDA明顯增高(P<0.05)，而2，3-DPG、FHb和滲透脆性無(wú)明顯變化(P>0.05)。 亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活后比起滅活前靜脈血，MDA明顯增高(P<0.05)，2，3-DPG、Na+K+-ATPase、Ca2+-ATPase、Mg2+-ATPase、FHb和滲透脆性均無(wú)明顯變化(P>0.05)。 三、流變學(xué)

15、檢測(cè)結(jié)果 用流變儀檢測(cè)各樣本流變學(xué)指標(biāo)，測(cè)得術(shù)中回收血與術(shù)前靜脈血比較：中、高切粘度明顯降低，卡松粘度明顯增高;全血低切粘度、血漿粘度、血液相對(duì)粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及屈服應(yīng)力無(wú)明顯變化(P>0.05)。 核黃素光化學(xué)法滅活后與滅活前靜脈血比較，全血低切粘度、血液相對(duì)粘度明顯降低(P<0.05)，其他流變學(xué)指標(biāo)均無(wú)明顯變化(P>0.05)。亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活后與滅活前靜脈血比較，除屈服應(yīng)力明顯增大外(P<0.05)，其他均

16、無(wú)明顯變化(P>0.05)。 四、流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到紅細(xì)胞表面無(wú)乙肝病毒的表達(dá)。 五、病毒滅活效果檢測(cè) 1、HBV C基因擴(kuò)增產(chǎn)物與GenBank所公布的HBV C基因序列有較好的一致性。 2、以1600uM核黃素滅活2h及以80uM亞甲藍(lán)滅活1.5h后，HBV C基因擴(kuò)增條帶明顯減弱，亞甲藍(lán)光化學(xué)法滅活后HBV DNA拷貝數(shù)明顯減少(P<0.05)，而核黃素光化學(xué)法滅活效果不明顯(P>0.05)。

17、 結(jié)論： 1、乙肝肝移植病人術(shù)中自體血液回收前后紅細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)及生理功能未受明顯影響，部分流變學(xué)指標(biāo)在回收前后有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 2、通過(guò)流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞表面無(wú)乙肝病毒表達(dá)。 3、核黃素光化學(xué)法對(duì)乙肝病毒滅活效果不明顯，對(duì)紅細(xì)胞生理功能和流變學(xué)有一定影響。該方法的各滅活參數(shù)和條件有待進(jìn)一步探討和優(yōu)化。 4、亞甲藍(lán)光化學(xué)在較低終濃度較短時(shí)間內(nèi)即能較明顯滅活乙肝病毒，對(duì)紅細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能無(wú)明顯影響。