毒害艾美爾球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構建與篩選及3-1E基因的克隆表達.pdf

1、雞球蟲病是由一種或數(shù)種艾美耳球蟲寄生于雞消化道上皮細胞內而引起的一種原蟲寄生蟲病，嚴重危害養(yǎng)雞業(yè)。目前，球蟲病的防治主要依賴化學藥物或雞球蟲病活疫苗，雖然人們采取了穿梭用藥、輪換用藥、聯(lián)合用藥等各種措施，但球蟲幾乎對所有使用過的抗球蟲藥物均出現(xiàn)了耐藥性。雞球蟲病活疫苗有著較強的免疫效果，但存在一些突出的問題，如有擴散病原的風險、疫苗接種劑量難以控制、影響飼料報酬等。因此，雞球蟲保護性抗原基因的篩選與克隆表達及其免疫保護力的研究一直是雞球

2、蟲病研究的熱點。毒害艾美耳球蟲（Eimeria necatrix）是雞球蟲病的重要病原，在臨床上常危害8～18周齡的雞，引起雞的急性小腸球蟲病。迄今，從毒害艾美耳球蟲克隆的抗原基因甚少。為此，本研究應用SMART技術構建了毒害艾美耳球蟲（E.necatrix）第二代裂殖子cDNA文庫，并用免疫學方法從文庫中篩選抗原基因，并對3-1E基因進行了克隆表達和免疫原性分析，為研究毒害艾美耳球蟲亞單位疫苗奠定基礎。
　　1、毒害艾美耳球蟲第

3、二代裂殖子的分離純化
　　28日齡無球蟲雛雞，每雞經嗉囊感染20000個毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊。感染150h后撲殺、剖檢雞，刮取小腸中段腸黏膜組織，研磨后用1 mmol/L透明質酸酶消化，釋放裂殖子;隨后經4層棉紗布、260目錦綸篩兜和17μm PET膜過濾，濾液經離心洗滌后用裂解液裂解紅細胞;最后用30％和50％的Percoll，5200 rpm離心15 min，分離純化裂殖子。結果表明，該方法操作程序簡單，分離效果好，獲得的

4、裂殖子無雜質，其純度適用于分子生物學方面的研究。
　　2、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的構建
　　用Trizol試劑提取毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RNA，用oliogo(dT)磁珠法純化mRNA，隨后采用SMART技術構建了毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA噬菌體表達文庫。經鑒定，原始文庫庫容量2.14×106 pfu/mL，擴增后的庫容量約為4.47×1010pfu/mL，擴增后的文庫重組率為90％;隨機挑取1

5、00個單克隆，通過菌液PCR檢測得知文庫插入片段長度以400 bp～1000 bp為主。結果顯示，構建的cDNA噬菌體表達文庫達到SMART高質量文庫指標。
　　3、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子cDNA文庫的篩選
　　首先，用毒害艾美耳球蟲孢子化卵囊經嗉囊感染雛雞，制備抗毒害艾美耳球蟲的雞康復血清;用純化的毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子可溶性蛋白為抗原免疫小鼠，制備鼠抗毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子多抗血清;兩種血清經ELISA檢測，

6、顯示兩種多抗均有很高的效價;隨后，按試劑盒規(guī)定方法，用雞康復血清和鼠抗代裂殖子血清對構建的cDNA文庫進行免疫學篩選，經初篩分別獲得出11個和7個陽性克隆，其中有5個克隆為雙陽性;接著，對5個雙陽性克隆進行復篩直至整個膜上均為陽性克隆為止;最后，對復篩后獲得的陽性克隆進行PCR鑒定，其PCR產物送公司測序，對獲得的EST序列進行生物信息學分析。結果顯示，5個EST序列的長度分別為599、723、516、939和899bp，編碼的蛋白分別

7、與毒害艾美耳球蟲假定蛋白，日本血吸蟲SJCHGC02770蛋白、SJCHGC00839蛋白和SJCHGC09095蛋白，柔嫩艾美耳球蟲核糖體蛋白P2，毒害艾美耳球蟲60S核糖體蛋白L8和柔嫩艾美耳球蟲50S核糖體蛋白L2，以及巨型艾美耳球蟲Ⅰ型細胞色素氧化酶有很高的同源性。
　　4、毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子3-1E基因的克隆表達
　　首先，根據堆型艾美耳球蟲子孢子3-1E基因序列設計引物，以毒害艾美耳球蟲第二代裂殖子總RN

8、A為模板，用RT-PCR方法擴增基因片段;將目的片段插入到pGEM-T-Easy載體，常規(guī)轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α，藍白斑篩選后對經酶切和PCR鑒定為陽性的重組質粒進行測序。隨后，根據3-1E基因的ORF序列和質粒pET-28a(+)酶切位點設計引物，以重組質粒pGEM-T-Easy-3-1E為模板擴增出表達片段，將該片段與載體pET-28a(+)連接，構建重組表達質粒pET-28a-3-1E，轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)