熒光素酶光成像適時(shí)監(jiān)測(cè)hTRAIL基因治療肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：以ad-hTRAIL、ad-luc和PBS作為對(duì)照，研究腫瘤內(nèi)直接注射腺病毒載體ad-luc-hTRAIL是否可以對(duì)A549細(xì)胞裸鼠移植瘤有治療作用；探討報(bào)告基因熒光素酶（luc）的表達(dá)是否可以反映病毒載體介導(dǎo)的治療基因人腫瘤壞死因子相關(guān)配體（hTRAIL）的表達(dá)情況，以及是否可以反映治療情況。
　　 方法：
　　 1建立肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型：常規(guī)方法體外培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞，收集細(xì)胞，消毒裸鼠背部皮膚，

2、皮下注射法建立移植瘤裸鼠動(dòng)物模型。
　　 2抗腫瘤療效觀察：直接瘤內(nèi)多點(diǎn)注射腺病毒載體ad-luc-hTRAIL，對(duì)照組注射ad-hTRAIL、ad-luc、PBS。于不同時(shí)間點(diǎn)（治療開(kāi)始后第4、7、10、14、21、28天）動(dòng)態(tài)觀察各實(shí)驗(yàn)組腫瘤生長(zhǎng)情況，測(cè)量腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，計(jì)算抑瘤率。
　　 3熒光素酶活性檢測(cè)：基因治療開(kāi)始后，于不同時(shí)間點(diǎn)利用高敏感、低溫CCD照相機(jī)進(jìn)行生物發(fā)光光成像檢查，在活體上動(dòng)態(tài)觀察

3、各組腫瘤部位的生物發(fā)光情況。
　　 4免疫組化法檢測(cè)hTRAIL蛋白表達(dá)情況：基因治療開(kāi)始后，于不同時(shí)間點(diǎn)處死部分裸鼠取腫瘤組織，觀察ad-hTRAIL、adduc-hTRAIL、PBS組腫瘤組織中hTRAIL蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行免疫組化評(píng)分（IHS）。
　　 5 TUNLE法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡情況：基因治療開(kāi)始后，于不同時(shí)間點(diǎn)處死部分裸鼠取腫瘤組織，觀察Ad-hTRAIL、Ad-luc-hTRAIL、PBS組腫瘤細(xì)胞凋亡

4、情況，并計(jì)算凋亡率。
　　 結(jié)果：成功建立A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，成瘤率100％。hTRAIL能夠抑制移植瘤生長(zhǎng)，基因治療開(kāi)始后，含治療基因hTRAIL的ad-luc-hTRAIL與ad-hTRAIL組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯較不含治療基因的ad-luc組及PBS對(duì)照組緩慢，第4、7、10、14、21、28天兩組抑瘤率分別為30.20％、43.93％、52.02％、65.67％、55.37％、51.20％和34.20％、52.67％

5、、55.70％、58.53％、56.67％、57.50％。腫瘤體積組間比較顯示，ad-luc-hTRAIL組與ad-luc組及PBS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），ad-hTRAIL，組與ad-luc組及PBS組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），ad-luc-hTRAIL、ad-hTRAIL兩組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.10）。生物發(fā)光成像結(jié)果顯示，含有l(wèi)uc報(bào)告基因的ad-luc組與ad-luc-hTRAIL組腫瘤部位于治療開(kāi)始后都能夠

6、表達(dá)熒光素酶，ad-luc-hTRAIL組熒光素酶活性于治療第七天達(dá)高峰后明顯下降，ad-luc組在治療后第4～14天內(nèi)均保持較高水平表達(dá)，第21、28天熒光素酶活性略有下降。而ad-hTRAIL與PBS組整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)發(fā)光。免疫組化檢測(cè)hTRAIL蛋白，并進(jìn)行免疫組化評(píng)分（IHS=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)×顯色強(qiáng)度），ad-luc-hTRAIL與ad-hTRAIL組腫瘤組織中大量表達(dá)hTRAIL蛋白，于第7天達(dá)到高峰（IHS峰值分別為6.25

7、+/-2.06、6.5+/-2.887），以后隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量逐漸下降。TUNLE法檢測(cè)腫瘤組織內(nèi)凋亡情況顯示，ad-luchTRAIL與ad-hTRAIL組中可觀察到大量腫瘤細(xì)胞凋亡，兩組的凋亡率于治療后第7天達(dá)到高峰（峰值分別為60.75+/-8.06％、61.50+/-8.47％），以后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。
　　 結(jié)論：
　　 1應(yīng)用雙基因表達(dá)的ad-luc-hTRAIL載體可有效將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入肺癌A549細(xì)胞裸