改良的玻璃化凍融方案對人類卵母細(xì)胞凍融效果的研究.pdf

1、第一部分胎牛清在不同操作溫度下對各成熟階段人類卵母細(xì)胞凍融效果的影響 目的：探索含65％胎牛血清（FCS）的玻璃化優(yōu)化液在不同的操作溫度下對各成熟階段人類卵母細(xì)胞的凍融效果。 方法：收集該中心行體外受精胚胎移植（IVF-ET）患者中受精失敗的成熟卵母細(xì)胞（metaphaseⅡ，MⅡ）和行卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）患者中丟棄的未成熟卵母細(xì)胞[MⅠ（metaphaseⅠ）、GV（germinal vesicle）]。MⅡ

2、卵母細(xì)胞用玻璃化方案凍融，玻璃化液為[15％乙二醇（EG）+15％二甲亞砜（DMSO）+0.5mol/l蔗糖（sucrose）+65％FCS]。凍融過程中在三種不同的溫度下操作分為A組、B組、C組。A組：卵母細(xì)胞冷凍時(shí)放置在預(yù)平衡液的溫度為37℃，而放置在玻璃化液（15％EG+15％DMSO）時(shí)轉(zhuǎn)在室溫（25±2℃），放置在解凍液的操作溫度為37℃；B組：卵母細(xì)胞放置在冷凍及解凍液的操作溫度均為室溫；C組：卵母細(xì)胞放置在冷凍及解凍液的操

3、作溫度均為37℃；未冷凍組為對照組（D組）。GV期卵母細(xì)胞采用同MⅡ期卵母細(xì)胞一樣的凍融程序分別對應(yīng)為GA、GB、GC和GD組。MⅠ期卵母細(xì)胞也采用同MⅡ卵母細(xì)胞一樣凍融程序分別對應(yīng)為MA、MB、MC和MD組。未成熟卵母細(xì)胞的對照組卵子及解凍后的存活卵子先進(jìn)行體外成熟（IVM），IVM后的MⅡ卵母細(xì)胞、凍融后存活的MⅡ卵母細(xì)胞及對照組的MⅡ卵母細(xì)胞固定后進(jìn)行免疫熒光染色，然后用Nikon CISI激光掃描共聚焦顯微鏡觀察紡錘體、染色體形

4、態(tài)。 結(jié)果： （1）實(shí)驗(yàn)A、B、C組卵母細(xì)胞凍融后的存活率分別為95.8％、95.8％和78.3％，各實(shí)驗(yàn)組間相互比較無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組A的紡錘體和染色體形態(tài)正常率（13％、13％）與對照組的的紡錘體和染色體形態(tài)正常率（18.2％、18.2％）比較均無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組A紡錘體的缺失率（Ⅳ型）為65.3％，與對照組紡錘體的缺失率（39.4％）相比無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組B紡錘體形態(tài)正常率為4.4％，C組的紡錘體和染色體形態(tài)

5、正常率均為0％，與對照組比較無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組B的染色體形態(tài)正常率與對照組的染色體形態(tài)正常率（0％比18.2％）比較有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組B、C紡錘體的缺失率（Ⅳ型）為78.2％、88.9％與對照組紡錘體的缺失率（39.4％）相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，紡錘體和染色體各型形態(tài)實(shí)驗(yàn)組間相互比較C組的Ⅲ型染色體與A組比較存在顯著性差異，其余組各型間的相互比較均無顯著性差異。 （2）實(shí)驗(yàn)組GA、GB、GC卵母細(xì)胞凍融后的存活率分別為100％、

6、83.3％、66.7％，各實(shí)驗(yàn)組間相互比較無顯著性差異，各實(shí)驗(yàn)組的體外成熟率為40％、100％、100％，各實(shí)驗(yàn)組間的MⅡ率相互比較及各實(shí)驗(yàn)組與對照組60％的MⅡ率相比，無顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組中只有GB組獲得了2個(gè)紡錘體和染色體形態(tài)正常卵母細(xì)胞，其余各實(shí)驗(yàn)組獲得的成熟卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體形態(tài)未有正常者，IVM后獲得MⅡ卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體正常率各實(shí)驗(yàn)組間相互比較及各實(shí)驗(yàn)組與對照組相比均無顯著性差異。 （3）實(shí)驗(yàn)組MA、MB

7、、MC的MⅠ期卵母細(xì)胞凍融后的存活率分別為71.4％、100％、83.3％，各實(shí)驗(yàn)組間相互比較無顯著性差異，MA組IVM后未獲得MⅡ卵子，MB、MC和對照組的體外成熟率分別為66.6％、80％、57.1％，各實(shí)驗(yàn)組間的MⅡ率相互比較：MA與MB、MC均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而MB與MC間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各實(shí)驗(yàn)組的MⅡ率（成熟率）與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各實(shí)驗(yàn)組與對照組均未得到紡錘體和染色體形態(tài)正常卵母細(xì)胞。 結(jié)論： （1）添加

8、65％FCS的改良玻璃化試劑對各成熟階段卵母細(xì)胞的復(fù)蘇存活率均得到良好的效果。 （2）MⅡ期卵母細(xì)胞在添加FCS的改良試劑中冷凍時(shí)放置在預(yù)平衡液的溫度為37℃，而放置在玻璃化液（15％EG+15％DMSO）時(shí)轉(zhuǎn)在室溫，解凍操作溫度為37℃的操作條件對紡錘體和染色體的損傷較小。 （3）放置在高濃度的玻璃化液時(shí)，應(yīng)選擇在室溫，使細(xì)胞脫水更平緩，能夠減少細(xì)胞脫水過程因體積劇烈變化帶來的損傷。 （4）GV期卵母細(xì)胞放置在

9、冷凍及解凍液的操作溫度均為室溫的凍融效果較好，體外成熟獲得的MⅡ卵母細(xì)胞的紡錘體和染色體正常率最高。 （5）MⅠ期卵母細(xì)胞放置在冷凍及解凍液的操作溫度均為37℃的凍融效果較好，解凍后存活卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)至MⅡ時(shí)間最短，成熟率最高。 第二部分兩種玻璃化凍融方案對人類成熟期卵母細(xì)胞的凍融效果比較 目的：比較兩種玻璃化凍融方案對人類成熟期（MⅡ）卵母細(xì)胞紡錘體、染色體的損傷程度。 方法：收集體外受精胚胎移植

10、中受精失敗的MⅡ卵母細(xì)胞，分別用兩種不同的玻璃化方案凍融，其中方案A：玻璃化保護(hù)試劑為（15％EG+15％DMSO+0.5mol/l蔗糖+65％FCS），操作條件：卵母細(xì)胞冷凍時(shí)放置在預(yù)平衡液的溫度為37℃，而放置在玻璃化液（15％EG+15％DMSO）時(shí)轉(zhuǎn)在室溫（25±2℃），放置在解凍液的操作溫度為37℃；方案B：玻璃化保護(hù)試劑為（15％EG+15％DMSO+0.5mol/l蔗糖），操作條件與A法一致；對照組為未冷凍卵母細(xì)胞。解凍后

11、的存活卵母細(xì)胞及對照組卵母細(xì)胞固定后進(jìn)行免疫熒光染色，然后用Nikon CISI（激光掃描共聚焦顯微鏡，confocal）觀察紡錘體、染色體形態(tài)。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組A、B卵母細(xì)胞的存活率分別為95.8％、96.7％，各實(shí)驗(yàn)組間相互比較無顯著性差異，實(shí)驗(yàn)組A卵母細(xì)胞的紡錘體、染色體正常率與對照組相比無顯著性差異（13％、13％比18.2％、18.2％），實(shí)驗(yàn)組B的紡錘體、染色體正常率與對照組比較有顯著性差異（0％、0％比18.2％、1