細(xì)胞衰老在TSLP通過Stat3信號通路誘導(dǎo)哮喘氣道重塑中的作用機制研究.pdf

1、研究背景：
　　支氣管哮喘的主要病理改變是氣道炎癥、平滑肌功能紊亂和氣道重塑。其中氣道重塑是固定性氣流受限、肺功能受損的病理生理基礎(chǔ)。氣道重塑的病理表現(xiàn)包括上皮功能與結(jié)構(gòu)的改變、微血管的重構(gòu)、平滑肌的增生與肥大等。其中氣道上皮的異常表現(xiàn)為對不同應(yīng)激因素的易感性增強，以及損傷后的異常修復(fù)。上皮細(xì)胞被認(rèn)為是在組織損傷時最具活性的組織細(xì)胞之一。在上皮細(xì)胞自身修復(fù)的過程中，成熟上皮細(xì)胞分泌多種炎前因子，如胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)

2、、白介素25（IL-25）、白介素33(IL-33)等刺激基質(zhì)部分的重塑過程，TSLP是由氣道上皮特應(yīng)性損傷后釋放，從而誘導(dǎo)氣道炎癥的關(guān)鍵因子，其受體TSLPR（胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素受體）可以通過白介素13(IL-13)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)和信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TSLP可激活MAPKs的三類蛋白激酶（P38、JNK和ERK1/2），進(jìn)一步誘導(dǎo)誘導(dǎo)Stat3磷酸化，引起炎癥細(xì)胞因子、趨化因子

3、的釋放，參與氣道炎癥反應(yīng)。
　　衰老是一種重要的防御機制，主要起源于對端粒的侵蝕和應(yīng)激反應(yīng)。細(xì)胞衰老在多種慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病和哮喘的組織中較為常見。慢性炎癥反應(yīng)是哮喘一個重要的組織學(xué)特點，并且在氣道重塑中發(fā)揮著重要的作用，慢性炎癥也是組織應(yīng)激反應(yīng)的一種表現(xiàn)形式。因此，在哮喘氣道上皮中發(fā)生細(xì)胞衰老不足為奇。P16和p21均參與了細(xì)胞衰老過程。有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者p21的上調(diào)，且其上調(diào)水平和哮喘的嚴(yán)重性密切相關(guān)。在哮喘的發(fā)生發(fā)

4、展過程中，一些細(xì)胞因子，如硫氧化還原蛋白(TRX)可通過降低氣道上皮細(xì)胞TGF-β1、EGFR和p21的表達(dá)，進(jìn)一步阻止哮喘小鼠氣道重塑模型的建立。
　　根據(jù)國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究，目前尚未解決的問題是①TSLP在哮喘氣道重塑中的作用;②TSLP能否通過Stat3信號通路誘導(dǎo)哮喘氣道重塑;③細(xì)胞衰老是否參與哮喘氣道重塑，及細(xì)胞衰老在TSLP誘導(dǎo)的哮喘氣道重塑中作用機制尚不明確，均需進(jìn)一步探討。
　　研究目的:
　　1.探討

5、TSLP在哮喘氣道重塑中的作用;
　　2.研究TSLP通過Stat3信號通路在哮喘氣道重塑中發(fā)揮的作用
　　3.探索細(xì)胞衰老在哮喘氣道重塑中的作用，及細(xì)胞衰老對TSLP誘導(dǎo)的哮喘氣道重塑中的影響;
　　4.在小鼠模型中，通過針對Stat3的靶向治療，評估干預(yù)Stat3信號通路對哮喘氣道重塑及細(xì)胞衰老的影響。
　　研究方法：
　　1.首先我們采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)觀察哮喘病人氣道粘膜上皮的氣道重塑

6、情況。為了明確TSLP、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)及Ⅰ型膠原蛋白在氣道粘膜上皮表達(dá)情況，我們從哮喘患者(n=10)和正常人(n=10)分別獲取了支氣管鏡活檢標(biāo)本，并用特異的抗體分別對其行免疫組織化學(xué)染色，同時對衰老標(biāo)記物p16、p21、ki67進(jìn)行檢測。
　　2.為了明確TSLP調(diào)控的信號通路的特征，首先我們采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測人類肺成纖維細(xì)胞(HLF-1)是否表達(dá)TSLP受體(TSLPR)。我們用TSL

7、P-shRNA或者TSLP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HLF-1下調(diào)或上調(diào)TSLP表達(dá)，采用westernblot和實時定量PCR(qPCR)方法進(jìn)行檢測相應(yīng)下游Stat3磷酸化水平，及在蛋白和mRNA水平檢測α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)情況。為了進(jìn)一步明確HLF-1細(xì)胞中的TSLP是否通過Stat3信號通路誘導(dǎo)哮喘氣道重塑，我們使用Stat3抑制劑處理經(jīng)TSLP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HLF-1，采用實時定量PCR和westernblot方法分別在mRNA和蛋白水平檢

8、測了α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)情況。
　　3.同時，我們在人支氣管上皮細(xì)胞系（BEAS-2B）中，觀察TSLP能否通過Stat3信號通路誘導(dǎo)氣道重塑，及細(xì)胞衰老在TSLP誘導(dǎo)的哮喘氣道重塑中的作用。首先采用TSLP重組蛋白刺激BEAS-2B，通過westernblot方法檢測Stat3磷酸化水平和α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)情況，同時采用westernblot、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)分析法、細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-

9、β-Gal)染色法、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測TSLP在支氣管上皮細(xì)胞衰老中的作用。我們首先應(yīng)用p16shRNA、p21shRNA轉(zhuǎn)染BEAS-2B，然后再使用TSLP刺激BEAS-2B，采用westernblot方法檢測Stat3磷酸化水平和α-SMA及Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)情況，采用BrdU分析法、SA-β-Gal、MTT分析法檢測TSLP對人氣道上皮細(xì)胞衰老的影響。同時，我們使用Stat3小分子抑制劑WP1066處理被轉(zhuǎn)染的BEAS-2B

10、后，再使用TSLP刺激細(xì)胞，通過westernblot檢測哮喘氣道重塑標(biāo)記物α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白及細(xì)胞衰老標(biāo)記物p16和p21的影響。通過BrdU分析法、SA-β-Gal方法觀察Stat3小分子抑制劑對支氣管上皮細(xì)胞細(xì)胞胞衰老的影響。
　　4.在哮喘的小鼠模型中，通過腹腔注射Stat3的靶向抑制劑WP1066，來檢測如果抑制細(xì)胞衰老是否會影響哮喘的氣道重塑。我們采用小鼠肺功能方法檢測各組小鼠氣道高反應(yīng)性，采用免疫組織化學(xué)方法檢

11、測各組小鼠氣道上皮重塑標(biāo)記物α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白，以及細(xì)胞衰老標(biāo)記物p16、p21和ki67的表達(dá)情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.通過HE染色，我們在哮喘病人氣道粘膜上皮中發(fā)現(xiàn)明顯重塑病理表現(xiàn)。通過免疫組織化學(xué)方法，我們發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞中TSLP，及重塑標(biāo)記物α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較對照組明顯增高（分別為:p＜0.05，p＜0.05，p＜0.05）。衰老標(biāo)記物p16及p21兩者的蛋白水平在哮喘病人中是上調(diào)的（分別為

12、p＜0.05，p＜0.05），ki67蛋白的表達(dá)水平較對照組降低（p＜0.05）。
　　2.首先我們發(fā)現(xiàn)人肺成纖維細(xì)胞系HLF=1表達(dá)TSLP受體，HLF-1經(jīng)TSLP-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，通過westernblot分析法我們發(fā)現(xiàn)TSLP及Stat3磷酸化水平較對照組明顯增高（分別為:p＜0.05，p＜0.05），α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白在蛋白水平和相應(yīng)mRNA水平較對照組明顯增高（分別為:p＜0.05，p＜0.05）;在加入Stat3抑

13、制劑之后，Stat3磷酸化、α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白在蛋白和mRNA水平上的表達(dá)均下調(diào)，均有統(tǒng)計學(xué)意義。但是Stat5及其磷酸化水平無明顯變化(p＞0.05)。在轉(zhuǎn)染TSLP-shRNA的HLF-1細(xì)胞中，通過westernblot、qPCR檢測方法，我們發(fā)現(xiàn)TSLP、Stat3磷酸化水平、α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較對照組明顯降低，均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.在支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B中，在用梯度TSLP處理細(xì)胞之后，我們

14、發(fā)現(xiàn)TSLP誘導(dǎo)p16和p21的上調(diào)呈現(xiàn)TSLP劑量依賴的特征;TSLP可以增強Stat3磷酸化水平。同時我們通過BrdU標(biāo)記法和SA-β-gal染色法發(fā)現(xiàn)，TSLP可以促進(jìn)支氣管上皮細(xì)胞衰老，通過免疫細(xì)胞熒光方法發(fā)現(xiàn)TSLP可以抑制ki67的表達(dá)，以上研究均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　我們使用shp16和（或）shp21穩(wěn)定轉(zhuǎn)染BEAS-2后，通過westernblot檢測方法發(fā)現(xiàn)，單獨沉默p16或p21并不能抑制TSLP刺激后引起的氣

15、道重塑標(biāo)記物Ⅰ型膠原蛋白和α-SMA的表達(dá)以及Stat3的磷酸化水平，同時沉默p16和p21后可以抑制TSLP介導(dǎo)的氣道重塑和Stat3的磷酸化;通過SA-β-gal染色法、BrdU分析法和MTT分析發(fā)現(xiàn)單獨沉默p16或p21并不能抑制TSLP誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，同時沉默p16和p21卻可以明顯的抑制TSLP誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老，以上研究均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　然后我們在BEAS-2B細(xì)胞中加入了Stat3的抑制劑WP1066，然后加入TSL

16、P，通過westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平明顯較對照組降低，Stat3磷酸化水平明顯受到抑制，同時發(fā)現(xiàn)p21和p16的表達(dá)亦明顯受到抑制。通過SA-β-gal染色、BrdU分析法發(fā)現(xiàn)WP1066可以抑制TSLP誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的衰老，以上研究均有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.在哮喘小鼠模型中，通過腹腔注射Stat3的靶向抑制劑WP1066，我們通過監(jiān)測小鼠肺功能發(fā)現(xiàn)雞卵白蛋白(OVA)處理組小鼠氣道反應(yīng)性

17、較正常對照組明顯增高(p＜0.05)，WP1066處理組小鼠氣道反應(yīng)性較OVA組明顯降低(p＜0.05)。通過免疫組織化學(xué)染色方法，我們發(fā)現(xiàn)OVA組小鼠氣道粘膜上皮哮喘重塑標(biāo)記物α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)較對照組明顯增高(分別為:p＜0.05，p＜0.05)，衰老標(biāo)記物p16和p21表達(dá)較對照組明顯增高（分別為:p＜0.05，p＜0.05），ki67表達(dá)較對照組明顯降低（p＜0.05）;WP1066處理組小鼠α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白表

18、達(dá)水平較OVA組明顯降低（分別為:p＜0.05，p＜0.05），p16和p21表達(dá)較OVA組降低(分別為:p＜0.05，p＜0.05)，ki67表達(dá)較OVA組增強(p＜0.05)。
　　研究結(jié)論：
　　1.哮喘病人氣道粘膜上皮TSLP高表達(dá)，伴隨α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的過度表達(dá);同時也伴隨著衰老標(biāo)記物p16和p21的高表達(dá);
　　2.在人類肺成纖維細(xì)胞中，TSLP可以通過Stat3信號途徑介導(dǎo)α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白