1,25-二羥維生素D3在哮喘氣道重塑中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、哮喘是全球最常見的慢性疾病之一，發(fā)病率逐年增高并造成巨大的經(jīng)濟(jì)及社會(huì)負(fù)擔(dān)，因此研究哮喘的發(fā)生、發(fā)展及防治，已成為當(dāng)前人口與健康領(lǐng)域的前沿課題。近年來氣道重塑，又稱氣道重建或重構(gòu)，被認(rèn)為是哮喘發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，它在哮喘發(fā)病機(jī)制和治療中的作用越來越受到關(guān)注。氣道重塑是以氣道壁的細(xì)胞和分子的組成、數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化為特征的一系列慢性損傷和修復(fù)過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)沉積、基底膜增厚、氣

2、道平滑肌增生和肥大等。作為哮喘的特征性病理變化，氣道重塑是哮喘慢性化、持續(xù)化、嚴(yán)重化的病理基礎(chǔ)，是哮喘中存在的不可逆性氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性的病理基礎(chǔ)，也是激素抵抗性哮喘的病理基礎(chǔ)。治療哮喘必須與防治氣道重塑相結(jié)合，才是真正意義上的控制。
　　1,25-二羥維生素D3(1,25-dihydroxyvitaminD3,1,25-(OH)2D3)是體內(nèi)維生素D3最重要的活性代謝產(chǎn)物，主要通過與維生素D受體(vitaminDrecept

3、or,VDR)的結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。隨著研究的深入，目前發(fā)現(xiàn)1,25-(OH)2D3除外經(jīng)典的調(diào)節(jié)體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)及鈣磷代謝平衡的生理功能，還具有更為廣泛的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。
　　哮喘是一種由遺傳和環(huán)境因素共同作用的復(fù)雜的多基因遺傳病，新近研究明確VDR基因是哮喘的易感基因，其多態(tài)性參與了哮喘的發(fā)生及發(fā)展，提示1,25-(OH)2D3可能在某種程度上通過與VDR的配體-受體效應(yīng)來調(diào)節(jié)哮喘。對(duì)1,25-(OH)2D3功能的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，它

4、在哮喘的免疫應(yīng)答及慢性氣道炎癥發(fā)面均發(fā)揮復(fù)雜的調(diào)控作用，揭示了1,25-(OH)2D3在哮喘治療中的潛在應(yīng)用前景。但目前國內(nèi)外尚無其調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑的相關(guān)研究報(bào)道。本課題從體內(nèi)及體外兩方面，研究1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘氣道重塑的調(diào)節(jié)作用并初步探討相關(guān)作用機(jī)制，旨在加深對(duì)1,25-(OH)2D3參與哮喘發(fā)病機(jī)制的理解，為擴(kuò)展其在哮喘治療中的臨床運(yùn)用提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　本項(xiàng)研究共分三部分：
　　第一部分1,25-二

5、羥維生素D3對(duì)哮喘小鼠模型氣道重塑及MMP-9表達(dá)的影響
　　目的：觀察1,25-二羥維生素D3對(duì)哮喘小鼠氣道重塑及肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloprotease-9,MMP-9)表達(dá)的影響，探討它在哮喘治療中的作用。方法：BALB/c小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、VD組及DEX(dexamethasone,地塞米松)組。卵白蛋白(ovalbumin,OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘小鼠氣道重塑模型；HE染色觀察氣

6、道結(jié)構(gòu)改變；計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定氣道形態(tài)學(xué)指標(biāo)；明膠酶譜法檢測(cè)各組小鼠肺組織中MMP-9的活性；同時(shí)采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)各組MMP-9的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：(1)VD組能部分逆轉(zhuǎn)哮喘氣道重塑的特征性病理改變；(2)VD組的支氣管壁厚度、支氣管壁平滑肌層厚度及支氣管壁平滑肌細(xì)胞核數(shù)量均顯著低于哮喘組(P<0.05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)；(3)VD組肺組織MMP-9活性及其mRNA表達(dá)水平均明顯低于哮喘組(P<0.

7、05)，但仍高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：1,25-(OH)2D3的干預(yù)可顯著減輕哮喘氣道重塑的病理改變，有效抑制氣道平滑肌細(xì)胞(airwaysmoothmusclecells,ASMCs)的增生；并可通過部分抑制肺內(nèi)MMP-9的表達(dá)來延緩哮喘氣道重塑的進(jìn)程。
　　第二部分1,25-二羥維生素D3對(duì)被動(dòng)致敏人氣道平滑肌細(xì)胞增殖及表達(dá)MMP-9、ADAM33的影響
　　目的：檢測(cè)1,25-二羥維生素D3對(duì)被動(dòng)致敏人氣道平滑

8、肌細(xì)胞(humanairwaysmoothmusclecells,HASMCs)的增殖及表達(dá)MMP-9、解整合素-金屬蛋白酶33(adisintegrinandmetalloprotease33,ADAM33)的影響，從細(xì)胞水平探討1,25-(OH)2D3對(duì)哮喘氣道重塑的作用機(jī)制。方法：原代培養(yǎng)并被動(dòng)致敏HASMCs，以1,25-(OH)2D3作為干預(yù)因素。MTT法檢測(cè)10-10～10-7M的1,25-(OH)2D3對(duì)HASMCs增殖的

9、影響并確定其最佳作用濃度；而后用最佳作用濃度的1,25-(OH)2D3預(yù)處理HASMCs，MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖活力，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞核增殖抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表達(dá)；同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白免疫印記法分別檢測(cè)細(xì)胞中MMP-9及ADAM33的表達(dá)情況。結(jié)果：(1)1,25-(OH)2D3在生理濃度(10-10M)下并不影響被動(dòng)致敏HASMC

10、s的增殖(P>0.05)，但其在10-9、10-8、10-7M濃度下均能顯著抑制被動(dòng)致敏HASMCs的增殖，且表現(xiàn)為濃度依賴性(P<0.05)；當(dāng)濃度達(dá)到10-7M時(shí)，1,25-(OH)2D3抑制作用最強(qiáng)，故把此濃度作為實(shí)驗(yàn)的最佳濃度運(yùn)用于之后的所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；(2)10-7M的1,25-(OH)2D3對(duì)被動(dòng)致敏HASMCs的抗增殖作用呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；(3)1,25-(OH)2D3顯著抑制被動(dòng)致敏HASMCs中PCNA陽性表達(dá)率，并抑制細(xì)

11、胞周期中G1/S的轉(zhuǎn)化；(4)1,25-(OH)2D3明顯下調(diào)被動(dòng)致敏HASMCs中MMP-9與ADAM33的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：1,25-(OH)2D3能直接抑制被動(dòng)致敏HASMCs的增殖并下調(diào)其MMP-9、ADAM33表達(dá)，這種多重抑制作用可能是1,25-二羥維生素D3調(diào)節(jié)哮喘氣道重塑的作用機(jī)制之一。
　　第三部分NF-κB信號(hào)通路在1,25-二羥維生素D3調(diào)節(jié)被動(dòng)致敏HASMCs過程中的作用研究
　　目的：探

12、討核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)在1,25-二羥維生素D3調(diào)節(jié)被動(dòng)致敏HASMCs過程中的信號(hào)傳導(dǎo)作用。方法：原代培養(yǎng)HASMCs并隨機(jī)分為三組：對(duì)照組、哮喘組及VD組，EMSA法檢測(cè)NF-κB的DNA結(jié)合活性；間接免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)觀察NF-κB亞基p65的核易位情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)VDR、CYP24及IκBα的mRNA表達(dá)水平；并用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組IκBα的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果

13、：(1)正常HASMCs表達(dá)VDR，哮喘血清的刺激并不影響其表達(dá)，而1,25-(OH)2D3卻顯著上調(diào)VDR及CYP24的mRNA表達(dá)水平；(2)VD組NF-κB的DNA結(jié)合活性較哮喘組明顯減弱(P<0.01)，但仍強(qiáng)于對(duì)照組(P<0.01)；(3)1,25-(OH)2D3顯著削弱被動(dòng)致敏HASMCs胞核NF-κBp65的熒光強(qiáng)度(P<0.01)，即顯著抑制了NF-κBp65的核易位；(4)1,25-(OH)2D3顯著上調(diào)被動(dòng)致敏HAS