巨噬細胞移動抑制因子在慢性哮喘氣道重塑中的作用初探.pdf

1、巨噬細胞移動抑制因子（MIF）系由T細胞產(chǎn)生的在體外能抑制巨噬細胞移動，并能在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)中促進巨噬細胞聚集的一種多功能細胞因子。近年來，人和鼠的實驗均證實了MIF在哮喘氣道炎癥中的重要作用，但其是否在氣道重塑中起作用尚未闡明。本研究首先觀察了慢性哮喘小鼠肺中MIF的表達，并用MIF小分子拮抗劑ISO-1（（S，R）3-（4-hydroxyphenyl）-4，5-dihydro-5-isoxazole acetic acid meth

2、yl ester，ISO-1）干預(yù)哮喘小鼠，初步探討了MIF在氣道重塑中的作用；同時在體外觀察了重組MIF（rMIF）對人肺成纖維細胞MRC-5增殖、膠原分泌及促其向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的影響，并深入探討了rMIF對人肺成纖維細胞影響的機制，進一步闡明MIF在哮喘氣道重塑中的作用。 目的: 1.觀察MIF在慢性哮喘小鼠肺中的表達，觀察地塞米松對其的調(diào)節(jié)作用； 2.以MIF小分子拮抗劑ISO-1干預(yù)哮喘小鼠，觀察其

3、對氣道炎癥和氣道重塑的影響； 3.用不同濃度的rMIF刺激MRC-5細胞，觀察其對MRC-5細胞增殖、膠原合成和促MRC-5細胞向肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化的影響，選出最適刺激濃度和時間； 4.觀察Y27632拮抗rMIF誘導(dǎo)MRC-5細胞膠原合成、細胞表型轉(zhuǎn)化的效果；觀察rMIF對磷酸化肌球蛋白目標(biāo)亞單位1（phosphorylated myosin phosphatase target subunit1，p-MYPT1）和

4、細胞培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）蛋白濃度的影響。 方法: 1.慢性哮喘小鼠模型的建立及分組 雌性C57BL/6純系小鼠48只，隨機分為6組，每組8只。哮喘組（OVA組）第1、14 d每只小鼠腹腔注射0.2 ml致敏液[含OVA10μg，氫氧化鋁凝膠100μg]，第21 d開始，霧化吸入2.5%的OVA30 min，每周3次，連續(xù)6周，每次霧化

5、前0.5h腹腔注射DMSO0.02ml。ISO-1組和地塞米松組（DEX組）以上述同樣的方法用OVA進行致敏和激發(fā)小鼠，在每次霧化OVA前0.5 h分別腹腔注射溶于DMSO的ISO-1溶液0.02ml或DEX溶液0.02ml，對照組（Control組）、ISO-1’組和DEX’組分別于第1、14 d每只小鼠腹腔注射0.2 ml NS，第21d開始，霧化吸入NS30 min每周3次，連續(xù)6周，每次霧化前0.5h均分別腹腔注射DMSO0.0

6、2ml、溶于DMSO的ISO-1溶液0.02ml或DEX溶液0.02ml。 2.MIF在慢性哮喘小鼠肺中的表達 在末次激發(fā)24h后，麻醉后開胸結(jié)扎右肺，左肺行肺泡灌洗，收集灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。處死小鼠，切下右肺提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用半定量RT-PCR法檢測肺中MIF mRNA的表達。左肺石蠟包埋切片，免疫組化法檢測MIF在肺中的表達。 3.M

7、IF小分子拮抗劑ISO-1對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道重塑程度的影響 BALF離心、重懸，瑞吉液染色做細胞分類計數(shù)。肺組織石蠟切片HE染色，IPP6.0圖像分析軟件分析單位長度基底膜氣道壁面積（total bronchial wall area/basement membrane perimeter，WAt/Pbm）、單位長度基底膜的氣道平滑肌面積（the area of the wall occupied by smooth m

8、uscle/basement membrane perimeter，WAm/Pbm）； Masson's Trichrome染色檢測上皮下膠原沉積，Alcian Blue and periodic acid-Schiff（AB-PAS）染色檢測氣道壁杯狀細胞增生，半定量RT-PCR法檢測肺中TGF-β1mRNA的表達，ELISA法檢測BALF中TGF-β1蛋白的表達。 4.rMIF對MRC-5細胞增殖、膠原合成和向肌成纖維細胞表

9、型轉(zhuǎn)化的影響 以不同濃度（0μg/L，25μg/L，50μg/L和100μg/L）的rMIF刺激MRC-5細胞。CCK-8法檢測刺激后MRC-5細胞增殖。羥脯氨酸法檢測細胞培養(yǎng)上清膠原蛋白含量。收集刺激后的MRC-5細胞提取總RNA，半定量RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA的表達。提取刺激后MRC-5細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分析后采用western blotting檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白的表達

10、。 5.rMIF促MRC-5細胞膠原合成、細胞表型變化機制 以100μg/L的rMIF刺激MRC-5細胞48小時，在刺激前0.5h加入Rho激酶特異性抑制劑Y27632，收集刺激后的MRC-5細胞提取總RNA，半定量RT-PCR法檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA mRNA的表達。提取刺激后MRC-5細胞總蛋白，SDS-PAGE電泳分析后采用western blotting檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和α-SMA蛋白的表達。以100μg/

11、L的rMIF刺激MRC-5細胞6h、12h、24h和48h，提取刺激后MRC-5細胞總蛋白和收集細胞培養(yǎng)上清，SDS-PAGE電泳分析后采用western blotting檢測p-MYPT1蛋白的表達，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清TGF-β1蛋白的表達。 6.統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進行處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，CCK-8結(jié)果采用析因設(shè)計的方差分析；兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組均數(shù)比

12、較采用單向方差分析（One-Way ANOVA），各組間多重比較采用LSD法；若方差不齊則采用t’檢驗和近似F檢驗（Welch方法）以及Games-Howell法進行多重比較；相關(guān)分析采用Pearson法。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果: 1.OVA致敏激發(fā)后，成功建立慢性哮喘模型。Control、ISO-1’和DEX’組霧化后無明顯異常反應(yīng)。OVA組激發(fā)后，出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、兩便失禁等癥狀，

13、用聽診器聽診可聞及哮鳴音。ISO-1、DEX組也出現(xiàn)與OVA組相似癥狀，但程度明顯較輕。 2.RT-PCR擴增結(jié)果顯示，與Control組比較，OVA組和ISO-1組MIF mRNA表達均顯著增加（P均<0.01），DEX組MIF mRNA表達無顯著變化，ISO-1’組、DEX’組MIF mRNA表達無顯著變化；與OVA組比較，ISO-1組MIF mRNA表達無顯著減少，DEX組MIF mRNA表達顯著減少（P<0.01）；與D

14、EX組比較，ISO-1組MIF mRNA表達顯著增加（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，MIF蛋白主要在小鼠氣道上皮細胞、上皮下粘膜和炎癥細胞中表達。與Control組比較，OVA組、ISO-1組和DEX組中MIF蛋白表達均顯著增加（P均<0.01），ISO-1’組、DEX’組肺中MIF蛋白表達無顯著變化（P>0.05）；與OVA組比較，DEX組MIF蛋白表達顯著減少（P<0.01），ISO-1組MIF蛋白表達無顯著變化（P>0.05）

15、；與DEX組比較，ISO-1組MIF蛋白表達顯著增多（P<0.01）。 3.BALF中細胞分析結(jié)果顯示，與Control組小鼠比較，OVA組、ISO-1組和DEX組小鼠BALF中總細胞、淋巴細胞、EOS均顯著增加（P均<0.01），ISO-1’組、DEX’組小鼠BALF中總細胞、淋巴細胞、EOS無顯著變化（P>0.05）；與OVA組比較，ISO-1組和DEX組中總細胞、淋巴細胞、EOS均顯著下降（P均<0.05）。 4.

16、HE染色圖像分析結(jié)果表明，與Control組比較，OVA組、ISO-1組和DEX組WAt/Pbm均顯著增高（P<0.01），ISO-1’組、DEX’組WAt/Pbm無顯著差別；與OVA組比較，ISO-1組和DEX組WAt/Pbm均顯著下降（P均<0.05）；與DEX組比較，ISO-1組WAt/Pbm與其WAt/Pbm無顯著差別（P>0.05）。 5.HE染色圖像分析結(jié)果表明，與Control組比較，OVA組、ISO-1組和DEX

17、組WAm/Pbm均顯著增高（P<0.01），ISO-1’組、DEX’組WAm/Pbm無顯著差別（P>0.05）；與OVA組比較，ISO-1組和DEX組WAm/Pbm均顯著下降（P均<0.05）；與DEX組比較，ISO-1組WAm/Pbm與其WAm/Pbm無顯著差別（P>0.05）。 結(jié)論： 1、MIF可能參與小鼠慢性哮喘氣道重塑過程； 2、MIF小分子拮抗劑ISO-1可減輕氣道重塑，其療效大致與DEX相當(dāng)；