細(xì)胞自噬在OVA和HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機(jī)制.pdf

1、支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘），是最常見(jiàn)的氣道慢性炎癥性疾病之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前全世界約有3億哮喘患者，其中中國(guó)有3千萬(wàn)左右，雖然發(fā)病率不高，但是病死率卻居高不下。哮喘是以嗜酸性粒細(xì)胞，肥大細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞等氣道局部浸潤(rùn)為主，主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性，粘液高分泌和可逆性的氣流受限。傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)型哮喘氣道炎癥主要表現(xiàn)為2型輔助性T(Th)細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和激活的肥大細(xì)胞的增多以及Th2型細(xì)胞因子（IL-4、IL-5和IL-13等）的

2、大量分泌。近年來(lái)一些研究表明一些新的細(xì)胞類型如TH17細(xì)胞，Treg細(xì)胞，DC細(xì)胞等，新型的細(xì)胞因子如IL-25，IL-33，TSLP在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，然而哮喘發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制至今仍未完全闡明。
　　細(xì)胞自噬是機(jī)體一種重要的保護(hù)和防御機(jī)制，在機(jī)體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)微環(huán)境改變的過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。在某些特定的環(huán)境（如饑餓，生長(zhǎng)因子缺乏，缺氧）下，細(xì)胞內(nèi)可以形成一種雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu)，該囊泡結(jié)構(gòu)

3、可以捕獲細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器（如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體等）和變性的蛋白質(zhì)，形成細(xì)胞自噬體，然后細(xì)胞自噬體可以與細(xì)胞內(nèi)的溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，進(jìn)而在溶酶體內(nèi)各種水解酶的作用下，將其內(nèi)的細(xì)胞器和生物大分子消化降解，從而為新的生物大分子合成提供原料和能量。細(xì)胞自噬過(guò)程（包括細(xì)胞自噬體的形成，細(xì)胞自噬體捕獲受損的細(xì)胞器和生物大分子的過(guò)程）受多種分子調(diào)控，這些分子統(tǒng)稱為Atg(autophagy-related)家族。其中Beclin-1（又稱

4、為Atg6）在細(xì)胞自噬體形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而LC3B（Atg8的同源蛋白）則在細(xì)胞自噬體捕獲受損細(xì)胞器和生物大分子的過(guò)程中非常重要，脂質(zhì)化的LC3BⅡ與LC3B本體LC3BⅠ的比例已經(jīng)被公認(rèn)為是WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞自噬的金標(biāo)準(zhǔn)。除此之外，目前已發(fā)現(xiàn)30種以上的Atg基因和蛋白與細(xì)胞自噬的分子機(jī)制有關(guān)。
　　雖然細(xì)胞自噬有利于維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是，在特定的情況下，細(xì)胞內(nèi)大量細(xì)胞器和生物大分子的消耗會(huì)導(dǎo)致其死亡

5、，稱之為細(xì)胞自噬死亡。所以在不同的情況下，細(xì)胞自噬可以保護(hù)細(xì)胞，也可以促進(jìn)細(xì)胞死亡，因此在不同疾病的發(fā)病過(guò)程中細(xì)胞自噬發(fā)揮著不同的作用。目前越來(lái)越多的研究證明細(xì)胞自噬在多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程中有重要的調(diào)控作用，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，肺動(dòng)脈高壓，急性肺損傷，囊性纖維病等，然而，關(guān)于細(xì)胞自噬在支氣管哮喘發(fā)病過(guò)程中的作用卻鮮有研究報(bào)導(dǎo)。
　　本實(shí)驗(yàn)分兩部分進(jìn)行研究:(1)利用細(xì)胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建OVA

6、誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥模型闡明細(xì)胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機(jī)制;(2)利用細(xì)胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥模型闡明細(xì)胞自噬在HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用，并通過(guò)骨髓移植技術(shù)探究細(xì)胞自噬在HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的作用機(jī)制。
　　第一部分細(xì)胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機(jī)制
　　目的:研究細(xì)胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機(jī)制。

7、>　　方法:健康的雄性C57BL/6小鼠，相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠，分別隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（WT/NS和LC3B/NS）和哮喘模型組（WT/OVA和LC3B/OVA）。哮喘模型組以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘模型生理鹽水對(duì)照組則以同等劑量的生理鹽水代替OVA，于最后一次OVA激發(fā)后24小時(shí)后處理小鼠，檢測(cè)其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細(xì)胞的總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞比例及絕對(duì)值，肺組織HE染色觀察氣道炎癥浸潤(rùn)的情況，PAS染色觀察粘液的

8、分泌情況，肺組織mRNA檢測(cè)一些炎癥因子的表達(dá)，ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。體外利用IL-13干預(yù)人肺上皮細(xì)胞BEASE-2B，Q-PCR檢測(cè)IL-25分泌的變化，。OVA干預(yù)人氣道上皮細(xì)胞HBE，Western Blot檢測(cè)LC3B表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:LC3B敲除后明顯緩解OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞比例和絕對(duì)值都明顯減少，肺部炎癥浸潤(rùn)明顯緩解，粘液分泌明顯下調(diào)，肺泡灌洗液中

9、炎癥因子的分泌，肺組織炎癥因子的表達(dá)也明顯下降。體外IL-13干預(yù)人氣道上皮細(xì)胞BEASE-2B均能誘導(dǎo)IL-25表達(dá)的增加，然而敲除自噬相關(guān)基因之后IL-25的表達(dá)則會(huì)明顯下調(diào)。且OVA干預(yù)人氣道上皮細(xì)胞HBE可以明顯誘導(dǎo)LC3B表達(dá)的增加。
　　結(jié)論:細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥，可能是通過(guò)抑制IL-25，IL-33等炎癥因子的分泌從而減輕氣道上皮細(xì)胞損傷實(shí)現(xiàn)的。
　　第二部分細(xì)胞自噬在H

10、DM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用
　　目的:研究細(xì)胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用。
　　方法:健康的雄性C57BL/6小鼠，相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠，分別隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（WT/NS和LC3B/NS）和哮喘模型組（WT/HDM和LC3B/HDM）。哮喘模型組以氣道滴注塵螨提取物(HDM)致敏和激發(fā)建立哮喘模型，生理鹽水對(duì)照組則以同等劑量的生理鹽水代替HDM。于最后一次HDM激發(fā)后48小時(shí)后處理小

11、鼠，檢測(cè)其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細(xì)胞的總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞比例及絕對(duì)值，肺組織mRNA檢測(cè)一些炎癥因子的表達(dá)，ELISA檢測(cè)肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。建立骨髓移植模型，將LC3B-/-骨髓移植到WT小鼠體內(nèi)，觀察骨髓內(nèi)敲除LC3B對(duì)哮喘表型是否有影響。然后將WT骨髓回輸?shù)絃C3B-/-小鼠體內(nèi)，觀察對(duì)于 LC3B-/-小鼠的哮喘表型是否有一定的“挽救”作用。
　　結(jié)果:LC3B敲除后明顯緩解HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞

12、總數(shù)，嗜酸性粒細(xì)胞比例和絕對(duì)值都明顯減少，肺泡灌洗液中炎癥因子的分泌，肺組織炎癥因子的表達(dá)也明顯下降。將LC3B-/-小鼠骨髓移植到WT小鼠體內(nèi)（相當(dāng)于骨髓特異性敲除LC3B），對(duì)HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥有一定的緩解作用;然而將WT-小鼠骨髓移植到LC3B-/-小鼠體內(nèi)，對(duì)于LC3B-/-小鼠的表型并沒(méi)有明顯的“挽救”作用。
　　結(jié)論:細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解HDM誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥，其調(diào)控作用主要在氣道上皮細(xì)胞層面，