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文檔簡介
1、第一部分人結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株的建立及特性
目的:建立穩(wěn)定的人結(jié)直腸癌耐奧沙利鉑細(xì)胞株,并檢測其部分特性,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。
方法:(1)在兩種人結(jié)直腸癌細(xì)胞株(SW480、SW620,稱之為親本細(xì)胞)的培養(yǎng)液中,通過逐漸提高化療藥物奧沙利鉑(Oxa)的濃度,建立穩(wěn)定的耐Oxa細(xì)胞株(SW480/OxR、SW620/OxR,稱之為耐藥細(xì)胞);(2)與親本細(xì)胞比較,采用以下方法檢測耐藥細(xì)胞株的一些生物學(xué)特性:采
2、用WST-1試劑檢測兩種細(xì)胞對(duì)化療藥物Oxa和5-FU的敏感性;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表達(dá)水平;采用流式間接法檢測耐藥相關(guān)蛋白(P-gp和S urvivin)表達(dá)情況;采用流式直接法檢測腫瘤干細(xì)胞(CSCs)標(biāo)記物CD44、CD133的表達(dá)情況;比較耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠后成瘤能力的變化;采用Western blot方法檢測上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)記
3、物(E-ca、N-ca、Vim)及Oct4蛋白的變化。
結(jié)果:細(xì)胞增殖試劑WST-1檢測細(xì)胞增殖情況結(jié)果為:親本細(xì)胞加藥(Oxa及5-FU)72h后細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01),而耐藥細(xì)胞加藥后細(xì)胞數(shù)量變化不大(P>0.05);耐藥細(xì)胞MDR-1、Survivin及Oct4mRNA表達(dá)水平較親本細(xì)胞明顯增高(P<0.01);耐藥細(xì)胞中P-gp+及Survivin+細(xì)胞比例較親本細(xì)胞明顯增高(P<0.01);耐藥細(xì)胞中C
4、SCs標(biāo)記物(CD133+及CD44+)表達(dá)比例明顯增多;耐藥細(xì)胞在NOD/SCID小鼠的致瘤性明顯增強(qiáng);SW620/OxR細(xì)胞相對(duì)于SW620細(xì)胞,間質(zhì)標(biāo)記物(N-ca及Vim)蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05及P<0.01),而上皮標(biāo)記物(E-ca)蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01);耐藥細(xì)胞Oct4mRNA及蛋白水平均明顯高于親本細(xì)胞(P<0.01)。
結(jié)論:耐藥細(xì)胞相對(duì)于親本細(xì)胞具有以下特性:多藥耐藥特性;EMT特
5、性(SW620/OxR細(xì)胞相對(duì)于SW620細(xì)胞);高表達(dá)CSCs標(biāo)記物(CD133及CD44);NOD/SCID小鼠致瘤性增強(qiáng);高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct4;說明耐藥細(xì)胞富集CSCs并高表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Oct4。
第二部分Oct4-shRNA慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定(外篩內(nèi)驗(yàn))
目的:構(gòu)建能夠有效沉默Oct4基因的Oct4-shRNA慢病毒載體,在人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞驗(yàn)證其對(duì)Oct4的抑制效率及其對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,并
6、探討其可能機(jī)制。
方法:(1)構(gòu)建針對(duì)Oct4的4個(gè)Oct4-shRNA干擾慢病毒載體質(zhì)粒(干擾序列分別稱為pSC-1、pSC-2、pSC-3、pSC-4),用Oct4與GFP融合的過表達(dá)質(zhì)粒分別與4個(gè)干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(稱之為外源篩靶實(shí)驗(yàn)),采用Western blot檢測GFP的表達(dá),篩選出干擾效果最好的Oct4-shRNA慢病毒載體,用293T細(xì)胞包裝;(2)轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)(稱之為內(nèi)源驗(yàn)證
7、實(shí)驗(yàn)):實(shí)驗(yàn)分3組:①空白對(duì)照組(Con):不轉(zhuǎn)染慢病毒,②陰性對(duì)照組(NC):轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒,③RNA干擾組(RNAi):轉(zhuǎn)染Oct4-shRNA慢病毒載體;對(duì)上述3組采用RT-qPCR檢測Oct4-mRNA,Western blot檢測Oct4、p-Akt蛋白,流式細(xì)胞儀測定Oct4+、CD44+細(xì)胞比例及腫瘤細(xì)胞凋亡情況。
結(jié)果:(1)在293T細(xì)胞的外源篩靶實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,含pSC-2干擾序列的Oct4-shRN
8、A慢病毒載體質(zhì)粒干擾效果最好(GFP蛋白表達(dá)量明顯減少);(2)在SW480細(xì)胞的內(nèi)源驗(yàn)證結(jié)果提示,與Con組及NC組比較,RNAi組SW480細(xì)胞Oct4的mRNA和蛋白表達(dá)均明顯下降(P<0.01),CD44+細(xì)胞比例明顯減少,p-Akt蛋白明顯受抑制(P<0.01),細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01),而Con組與NC組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
結(jié)論:我們成功構(gòu)建了能夠有效沉默Oct4基因的Oct4-shR
9、NA慢病毒載體,用其沉默Oct4基因可明顯減少SW480細(xì)胞中CD44+細(xì)胞比例,增加細(xì)胞凋亡,其作用可能與PI3K/Akt通路有關(guān)。
第三部分Oct4在富集腫瘤干細(xì)胞的結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞中抗凋亡作用及機(jī)制研究
目的:明確Oct4在富集CSCs的人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞株中是否具有抗凋亡作用,并探討其作用是否與S TAT3/Survivin通路有關(guān)。
方法:(1)采用Western blot方法比較STA
10、T3、磷酸化STAT3(P-STAT3)及Survivin蛋白在耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞的表達(dá)情況;采用免疫熒光法檢測Oct4與P-STAT3在耐藥細(xì)胞中的共表達(dá)情況。(2)Oct4-shRNA慢病毒載體沉默耐藥細(xì)胞(SW480/OxR和SW620/OxR)Oct4基因的實(shí)驗(yàn):兩種細(xì)胞均分以下2組:①陰性對(duì)照組(NC):轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照慢病毒,②RNA干擾組(RNAi):轉(zhuǎn)染Oct4-shRNA慢病毒載體;對(duì)上述2組采用RT-qPCR檢測Oct4
11、、STAT3及Survivin-mRNA變化;Western blot檢測Oct4、STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白的變化;采用流式直接法檢測CSCs標(biāo)記物CD44、CD133的變化;比較細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠后成瘤能力的變化;采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化。
結(jié)果:耐藥細(xì)胞與親本細(xì)胞比較,STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01或P<0.05);Oct4與P-S
12、TAT3(pY705)蛋白在耐藥細(xì)胞及親本細(xì)胞中均共表達(dá)于細(xì)胞核,耐藥細(xì)胞表達(dá)較親本細(xì)胞明顯增強(qiáng);Oct4-shRNA慢病毒載體沉默耐藥細(xì)胞Oct4基因后,STAT3及Survivin-mRNA水平明顯降低(P<0.01),STAT3、P-STAT3及Survivin蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01),腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD44+、CD133+細(xì)胞比例明顯下降,細(xì)胞凋亡明顯增加,NOD/SCID小鼠致瘤性明顯減弱,腫瘤生長明顯受抑制(P<0
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