白血病兒童骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性和免疫調(diào)節(jié)功能的初步研究.pdf

1、目的:通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究白血病兒童骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的生物學(xué)特性及其免疫調(diào)節(jié)作用，從而探討白血病兒童骨髓來(lái)源的MSCs在白血病兒童化療后實(shí)行自體回輸?shù)目尚行约翱赡艹霈F(xiàn)的免疫重建作用。 方法:通過(guò)Ficoll-Hypaque梯度密度離心法分離出白血病兒童骨髓單個(gè)核細(xì)胞，貼壁法體外純化擴(kuò)增MSCs，獲得第3～4（P3～4）代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。光鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)，瑞氏染色觀察細(xì)

2、胞核漿比例及形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)免疫表型，油紅O染色及茜素紅染色檢測(cè)其向脂肪及骨細(xì)胞分化等觀察其生物學(xué)特性。取外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cells，PB-MNCs），用植物凝集素（PHA）及白細(xì)胞介素2（IL-2）進(jìn)行刺激后將MSCs按照不同比例（1/5～1/1000）加入MNCs中，進(jìn)行細(xì)胞相互接觸的共培養(yǎng)、transwel

3、l體系的細(xì)胞非接觸性共培養(yǎng)，在培養(yǎng)第5天后收集懸浮細(xì)胞，用LDH法檢測(cè)各組中MNCs的增殖情況，用ELISA方法檢測(cè)單獨(dú)MNCs、加入不同比例的MSCs與MNCs接觸共培養(yǎng)體系中各組干擾素-γ（IFN-γ）和穿孔素（perforin）的分泌情況，再用流式細(xì)胞術(shù)分析單獨(dú)MNCs、不同比例MSCs：MNCs接觸共培養(yǎng)體系中T細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞CD4、CD25的免疫表型表達(dá)情況。 結(jié)果:白血病兒童骨髓來(lái)源的M

4、SCs在光鏡下觀察，呈梭形，并平行排列成漩渦狀生長(zhǎng)，瑞氏染色可見其胞核較大，細(xì)胞傳代后3d內(nèi)處于潛伏期，3d后進(jìn)入生長(zhǎng)期，8d后進(jìn)入平臺(tái)期。MSCs表達(dá)CD29、CD105、CD13，不表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR、CD14。在相應(yīng)的誘導(dǎo)條件下，可以向脂肪及骨細(xì)胞分化，油紅O染色及茜素紅染色呈陽(yáng)性。在MSCs與MNCs細(xì)胞相互接觸共培養(yǎng)體系中，當(dāng)MSCs：MNCs>1：100時(shí)，MSCs能抑制PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖

5、，隨MSCs數(shù)量增加，抑制作用更加明顯；隨MSCs數(shù)量減少，MSCs對(duì)PHA和IL-2刺激的MNCs的增殖抑制作用減弱，當(dāng)MSCs：MNCs≤1：100時(shí)，MSCs在一定程度上可促進(jìn)MNCs的增殖；而Transwell非接觸性共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠促進(jìn)MNCs的增殖。MSCs與MNCs不同比例共接觸培養(yǎng)后檢測(cè)IFN-γ及perforin的分泌，MSCs：MNCs=1：10時(shí)對(duì)細(xì)胞因子的分泌與受IL-2+PHA刺激后單獨(dú)MNCs培

6、養(yǎng)相比明顯下降。檢測(cè)接觸共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞亞群比例改變結(jié)果顯示，各組CD3+CD4+比例無(wú)明顯改變；當(dāng)MSCs：MNCs>1：100時(shí)，CD3+CD8+比例減少，CD4+CD25+hi比例升高；而當(dāng)MSCs：MNCs=1：1000時(shí)，CD3+CD4+，CD3+CD8+，CD4+CD25+hi比例與單獨(dú)MNCs培養(yǎng)時(shí)比例無(wú)明顯差異。 結(jié)論:①白血病患兒骨髓培養(yǎng)出的貼壁細(xì)胞是MSCs，骨髓含量在1ml以上且方法得當(dāng)可以培養(yǎng)出MSC

7、s。②初診的白血病患兒的骨髓相對(duì)容易培養(yǎng)出骨髓MSCs，且在體外擴(kuò)增速度較快。③白血病兒童來(lái)源的MSCs具有MSCs的共同生物學(xué)特性。④MSCs在體外對(duì)MNCs增殖的影響具有兩面性，而且呈劑量依賴性。在一定比例內(nèi)（本研究MSCs：MNCs>1：100時(shí)），MSCs對(duì)MNCs增殖的抑制作用隨著MSCs加入的濃度升高而增強(qiáng)；當(dāng)MSCs與MNCs小于一定比例（本研究MSCs：MNCs≤1：100）時(shí)，MSCs的抑制作用減少，有可能促進(jìn)MNCs