卵巢癌相關(guān)抗原CA125的原核表達(dá)、純化及其抗體的制備.pdf

1、CA125是由Bast等于1983年發(fā)現(xiàn)并命名，其血清學(xué)水平在卵巢癌等惡性腫瘤病人異常升高。CA125自發(fā)現(xiàn)以來一直作為卵巢癌常規(guī)篩查、輔助診斷及療效評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物。目前臨床檢測(cè)及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究等所用CA125抗體大多是依靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，限制其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用。因此，建立快速、高效、經(jīng)濟(jì)的制備CA125抗體的方法，對(duì)CA125試劑盒開發(fā)及相關(guān)基礎(chǔ)研究都具有重要的意義。
　　目的:
　　1.建立快速高效經(jīng)濟(jì)的C

2、A125串聯(lián)重復(fù)序列(CA125R)原核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)、分離純化CA125R蛋白并鑒定。
　　2.制備兔抗CA125R蛋白的抗血清，分離純化多克隆抗體并鑒定其識(shí)別天然CA125蛋白的特異性。
　　3.制備鼠抗CA125R蛋白的單克隆抗體，并鑒定其識(shí)別天然CA125糖蛋白的特異性。
　　方法:
　　1.全基因合成一段CA125串聯(lián)重復(fù)序列(CA125R)，并將此片段連接至pGEX-6P-1及pET-32a(+)原核

3、表達(dá)載體，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX/CA125R及pET/CA125R。
　　2.分別將pGEX/CA125R和pET/CA125R轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，確定最佳表達(dá)條件后，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，分別經(jīng)GST親和層析和鎳離子親和層析系統(tǒng)分離純化重組蛋白，并鑒定所純化的重組蛋白。
　　3.將純化的重組CA125R蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗血清，經(jīng)蛋白A抗體純化系統(tǒng)分離純化多克隆抗體，并鑒定。
　　4.將純化

4、的重組CA125R蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選陽性克隆，并進(jìn)一步克隆化，建立穩(wěn)定分泌抗CA125單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，采用小鼠腹水誘生法大量制備單克隆抗體，制備的抗體經(jīng)蛋白A純化系統(tǒng)純化并鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)基因重組技術(shù)，成功建立CA125R原核表達(dá)系統(tǒng)，分別通過GST親和層析及鎳離子親和層析系統(tǒng)分離純化得到GST-CA125R和TRAX-CA125R重組蛋

5、白。
　　2.將純化的TRAX-CA125R重組蛋白免疫家兔，制備其抗血清，并經(jīng)純化得到其多克隆抗體，多克隆抗體經(jīng)Western blot驗(yàn)證能特異識(shí)別天然CA125糖蛋白，具有應(yīng)用價(jià)值。
　　3.將純化的GST-CA125R重組蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤技術(shù)，將免疫的小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，成功獲得一株穩(wěn)定分泌抗CA125單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)腹水誘生及純化獲得高純度的抗CA125單克隆抗體。<