MiR-150對內(nèi)皮祖細胞促深靜脈血栓溶解再通作用的研究.pdf

1、深靜脈血栓形成(Deep venous thrombosis DVT)是常見的外周血管疾病,可導致肢體腫脹、下肢缺血、血栓后綜合癥,甚至致死性肺栓塞的發(fā)生?，F(xiàn)在對于DVT的治療主要是各種抗凝溶栓藥物的使用,但效果并不令人滿意,同時抗凝藥物的副作用可導致機體凝血功能下降、消化道出血、手術(shù)患者切口并發(fā)癥發(fā)生。
　　研究人員發(fā)現(xiàn)骨髓來源的內(nèi)皮祖細胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor c

2、ells BMEPCs)可以分化為血管內(nèi)皮細胞,分泌各種促血管生成因子從而促進缺血組織的血管新生。研究證實,EPCs可以歸巢到深靜脈血栓中促進血栓機化再通。我們實驗組前期的研究也發(fā)現(xiàn)移植EPCs后可以改善血栓內(nèi)的微環(huán)境,促進急性靜脈血栓溶解及慢性血栓再通。但是由于EPCs增殖能力及遷移歸巢能力較弱,EPCs的應用受到很大的限制。如何更好的改善 EPCs的功能成為廣大學者的研究方向。
　　MicroRNAs(miRNAs)是一類小分

3、子非編碼RNAs,可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達。研究證明MicroRNAs在血管新生過程中扮演了重要角色。miR-150最初被發(fā)現(xiàn)于免疫相關(guān)細胞中,控制著淋巴細胞的生長分化。研究發(fā)現(xiàn),miR-150可促進間充質(zhì)干細胞遷移。單核細胞分泌的miR-150可以提高人微血管內(nèi)皮細胞遷移及成血管能力。但是,miR-150對于EPCs的功能影響,特別在深靜脈血栓再通中的作用卻未見相關(guān)報道。
　　本實驗研究中,我們采用密度梯度離心法分離SD大鼠的

4、骨髓單個核細胞(Bone marrow-derived mononuclear cells, BMMNCs),EGM-2MV培養(yǎng)基誘導、培養(yǎng)、擴增骨髓源性EPCs并鑒定。體外實驗中,我們將對照寡核苷酸和miR-150的模擬物或抑制物采用電轉(zhuǎn)的方法,轉(zhuǎn)染EPCs,探討miR-150對EPCs的功能影響。為了進一步研究miR-150對EPCs在深靜脈血栓機化再通中的作用,我們構(gòu)建了攜帶miR-150的慢病毒表達載體并轉(zhuǎn)染到大鼠EPCs中,將

5、轉(zhuǎn)染后的EPCs注入到大鼠深靜脈血栓模型中。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達miR-150能夠促進大鼠EPCs的遷移成管能力,促進EPCs歸巢到靜脈血栓中,加速血栓的機化再通。我們的研究揭示了miR-150對EPCs功能的影響,可能為深靜脈血栓治療帶來新的希望。
　　本實驗研究,將分為4個部分。主要研究方法及結(jié)果如下。
　　第一部分大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:分離、培養(yǎng)并鑒定大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細胞(endo

6、thelial progenitor cells, EPCs)。
　　方法:采用密度梯度離心方法分離大鼠骨髓單個核細胞,采用內(nèi)皮培養(yǎng)體系EGM-2培養(yǎng)劑進行誘導分化定向誘導培養(yǎng)14-21天,觀察細胞的生長形態(tài)變化,結(jié)合免疫組化、免疫熒光、流式細胞儀技術(shù)檢測內(nèi)皮細胞表面標記及造血干細胞表面標記,采用Matrigel成管實驗及DiI-ac-LDL攝取實驗檢測內(nèi)皮細胞的功能學特性。
　　結(jié)果:新分離的骨髓單個核細胞(BMMNCs)

7、呈圓形,48 h后部分細胞開始貼壁,貼壁細胞呈紡錘型形態(tài),細胞集落形成,細胞培養(yǎng)至第10~12天逐漸融合,細胞形態(tài)呈現(xiàn)出鵝卵石樣改變。DiI-acLDL攝取結(jié)果顯示,細胞能夠吸收DiI-ac-LDL。Matrigel成管實驗顯示培養(yǎng)的細胞能形成管狀、網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)。流式細胞儀分析及免疫熒光檢測結(jié)果顯示,細胞主要表達內(nèi)皮特異性標記物VEGFR、vWF;幾乎不表達造血干細胞表面標記CD133。
　　結(jié)論:本實驗成功地建立了一套大鼠骨髓血管

8、內(nèi)皮祖細胞分離、培養(yǎng)、誘導分化及鑒定的方法體系。在特定培養(yǎng)體系誘導下,可從大鼠骨髓單個核細胞中獲得內(nèi)皮祖細胞,培養(yǎng)到第10-14天的內(nèi)皮祖細胞呈現(xiàn)late-EPCs表型特征。
　　第二部分 MiR-150對內(nèi)皮祖細胞功能影響的體外實驗研究
　　目的:探討miR-150對大鼠內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)增殖、遷移、及成管能力的影響
　　方法:將miR-150模擬物或抑制

9、劑或陰性對照用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)染到EPCs中。采用MTT、流式細胞術(shù)檢測miR-150對EPCs增殖及細胞周期的影響。采用劃痕實驗、穿膜實驗檢測miR-150對EPCs運動遷移能力的影響。采用Matrige管腔形成實驗檢測miR-150對EPCs成血管能力的影響。為了探查miR-150對EPCs功能影響的可能靶基因,我們使用在線microRNA數(shù)據(jù)庫尋找miR-150調(diào)控EPCs的潛在靶基因。
　　結(jié)果:miR-150對內(nèi)皮組細胞的增

10、殖及細胞周期沒有影響。劃痕實驗及穿膜實驗都證實了miR-150模擬物能夠顯著促進EPCs的遷移運動能力;miR-150抑制劑則能抑制EPCs的遷移運動能力。過表達miR-150能增強EPCs的成管能力。c-Myb的3’UTR區(qū)內(nèi)有miR-150兩個潛在的結(jié)合位點。
　　結(jié)論:miR-150對細胞增殖及細胞周期沒有作用。過表達miR-150促進大鼠EPCs遷移及運動及成管能力。c-Myb可能是miR-150的靶基因。
　　第三

11、部分構(gòu)建miR-150慢病毒表達載體及其在內(nèi)皮祖細胞有效性表達
　　目的:構(gòu)建miR-150慢病毒表達載體,感染大鼠EPCs后檢測miR-150的表達,為研究體內(nèi)條件下miR-150在EPCs中的生物學功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:將聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到的miR-150前體序列pre-miR-150和慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl經(jīng)酶切后連接產(chǎn)生pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150,經(jīng)酶

12、切及測序鑒定正確后在HEK293T細胞中包裝病毒,收集病毒上清后感染EPCs。用實時熒光定量PCR(qPCR)方法檢測感染后的EPCs中miR-150的表達。
　　結(jié)果:酶切及測序結(jié)果示慢病毒表達載體pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150構(gòu)建正確,病毒上清液感染EPCs后能有效提高miR-150的表達。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建了pLVX-IRES-ZsGreenl-miR-150慢病毒表達載體及穩(wěn)定表達miR-15

13、0的EPCs細胞系。
　　第四部分 miRNA-150對內(nèi)皮祖細胞在深靜脈血栓再通中的作用
　　目的:探討miRNA-150對大鼠內(nèi)皮祖細胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在血栓機化再通中的作用。
　　方法:我們通過結(jié)扎大鼠下腔靜脈構(gòu)建深靜脈血栓模型,將構(gòu)建成功的慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-IRES-ZsGreen1-miR-150轉(zhuǎn)染到EPCs中并

14、移植到血栓模型中。在術(shù)后7天、14天收集標本稱重。通過熒光示蹤觀察EPCs歸巢到靜脈血栓的情況。采用HE染色,CD34免疫組化染色觀察轉(zhuǎn)染miR-150后EPCs對靜脈血栓機化再通的影響。為了探查miR-150促進血栓機化再通的可能機制,我們采用免疫組化染色檢測血栓中MMP-2的表達情況。
　　結(jié)果:移植的EPCs出現(xiàn)在靜脈血栓中。EPCs/miR-150組中GFP陽性細胞數(shù)目較EPCs/vector組明顯增多。EPCs移植后抑制

15、靜脈血栓形成,EPCs/miR-150組中靜脈血栓的重量最低。HE染色和CD34免疫組化染色提示EPCs促進血栓的機化再通。相對于EPCs/vector組,EPCs/miR-150組中血栓機化再通最為明顯。不論在術(shù)后7天還是14天,MMP-2在EPCs/miR-150組和EPCs/vecto組的表達皆高于空白對照組。其中,EPCs/miR-150組中MMP-2的表達最為豐富。
　　結(jié)論:移植的EPCs可以歸巢到靜脈血栓中促進血栓溶