糖尿病大鼠視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜差異初步分析.pdf

1、目的： 1．應(yīng)用第二代差異顯示技術(shù)一限制性片段差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Differential Display-Polymerase ChainedReaction，RFDD-PCR)，通過(guò)建立大鼠糖尿病模型，在相同的遺傳背景下比較正常視網(wǎng)膜和糖尿病8周視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜的差異。探討RFDD-PCR用于初步大范圍篩選疾病相關(guān)基因的可行性，并確定下一步研究的候選基因。 2．進(jìn)一步觀

2、察篩選出的候選基因在糖尿病不同病程中視網(wǎng)膜的表達(dá)，初步探討其在糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)發(fā)生中可能的作用機(jī)制。 方法： 1．SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶制備糖尿病動(dòng)物模型。采用RFDD-PCR技術(shù)平行操作，建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜兩種基因表達(dá)譜。 2．應(yīng)用高電壓垂直電泳系統(tǒng)，以7％尿素變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離表達(dá)基因片段，Typhoon9200成像系統(tǒng)和圖像分

3、析軟件ImageQuantTL，ImageTool，F(xiàn)ragment Analysis軟件對(duì)凝膠圖象進(jìn)行分析，確定表達(dá)片段與差異表達(dá)片段數(shù)目。 3、通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)兩個(gè)樣本差異表達(dá)譜進(jìn)行分析，初步確定DR相關(guān)基因(或EST)，尋找有價(jià)值的候選片段。 4．隨機(jī)選組進(jìn)行重復(fù)操作，檢查方法的重現(xiàn)性。 5．通過(guò)半定量RT—PCR對(duì)篩選出的候選基因在糖尿病4周、8周、24周的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。 結(jié)果：

4、1．建立了大鼠糖尿病視網(wǎng)膜及正常視網(wǎng)膜基因表達(dá)譜：共獲得有意義的表達(dá)片段3639條，片段大小集中在50bp～1000bp之間，包括DR：1826條，NR：1813條。有差異的片段840條，占表達(dá)數(shù)的23.08％。與正常相比，糖尿病狀態(tài)下表達(dá)信號(hào)減弱的基因／EST片段283條，增強(qiáng)的225條，消失的145條，出現(xiàn)的187條。 2．7個(gè)“表達(dá)窗”重復(fù)試驗(yàn)的差異顯示片段數(shù)目，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差別無(wú)顯著性；差異條帶的位置、熒光強(qiáng)度和變化前

5、后基本一致。 3．差異表達(dá)譜生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，糖尿病狀態(tài)下： 1)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體 iGluRl表達(dá)明顯下調(diào)，iGlLtR2、iGlL,R3、iGlIJR4有不同程度下調(diào)。iGluR6輕度上調(diào)，iGluR5和iGl LIR7表達(dá)無(wú)變化。NMDA型受體明顯上調(diào)：mGluRl、4、5、7、8，均有不同程度上調(diào)。 2)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體GABA<,A>-R和GABAB-R上調(diào)，兩者相比，前者上調(diào)更為明顯

6、：GlyR表達(dá)無(wú)變化。 3)光感受器功能相關(guān)基因：GRKl、arrestin、phosdtlcin、rod CNGchannel和Rpe65全部下調(diào)。 4)細(xì)胞因子IL-18表達(dá)下調(diào)。 5)信號(hào)傳遞分子STAT5表達(dá)下調(diào)。 4．候選基因半定量RT-PER顯示 1)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)受體GluRl：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達(dá)明顯下調(diào)，8周、24周維持較低水平表達(dá)。 2)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)

7、受體GABA<,A>-R：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達(dá)明顯增強(qiáng)，8周、24周表達(dá)較4周時(shí)增強(qiáng)。 3)光感受器功能相關(guān)基因： GRKl：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜的表達(dá)開(kāi)始下調(diào)，8周時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，24周表達(dá)最低； Phosducin：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周時(shí)視網(wǎng)膜表達(dá)降低，8周時(shí)表達(dá)明顯下調(diào)，24周表達(dá)最低； rod CNG charmel：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達(dá)下

8、降，8周明顯下降，24周表達(dá)最低； Rpe65：與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病4周視網(wǎng)膜表達(dá)下降，8周明顯下降，24周表達(dá)最低。 4)細(xì)胞因子IL-18：與正常相比，糖尿病4周，視網(wǎng)膜高表達(dá)增強(qiáng)；8周表達(dá)降低：24周表達(dá)最低。 5)信號(hào)傳遞分子STAT5：正常及糖尿病4周視網(wǎng)膜未見(jiàn)表達(dá)，8周時(shí)可見(jiàn)表達(dá)，24周表達(dá)最強(qiáng)。 結(jié)論： 1．根據(jù)兩種狀態(tài)下大鼠視網(wǎng)膜64個(gè)“表達(dá)窗”所顯示的條帶總數(shù)，8個(gè)“表達(dá)窗”

9、重復(fù)實(shí)驗(yàn)差異片段的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，以及通過(guò)生物信息學(xué)方法比較所篩選出的候選基因數(shù)目和種類(lèi)看，RFDD-PCR由于具有高靈敏性、高覆蓋率、和高重現(xiàn)性的特點(diǎn)，可用于大范圍疾病相關(guān)基因的初步篩選。且可不受以往研究結(jié)果的限制，有利于尋找新的疾病研究切入點(diǎn)。 本課題借此方法篩選出了若干以往未見(jiàn)報(bào)道的DR相關(guān)基因，為DR發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的線(xiàn)索。 2．糖尿病早期，視網(wǎng)膜內(nèi)興奮性和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)受體、受體各亞型間表達(dá)方式，以及光感