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文檔簡介
1、目的: 1.建立正常大鼠視網(wǎng)膜和8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜基因差異表達譜,并通過生物信息學(xué)方法對表達譜進行分析,初步篩選糖尿病視網(wǎng)膜病變相關(guān)基因。 2.進一步驗證糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中相關(guān)因子在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上的表達變化,并對相關(guān)因子進行視網(wǎng)膜組織學(xué)定位,探索其在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞中的表達變化情況,為揭示糖尿病視網(wǎng)膜病變的病理機制提供依據(jù)。 方法: 1.sD大鼠腹腔注射四氧嘧啶制備糖尿病動物
2、模型。采用限制片段差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(Restriction Fragment Differential Display- Pol ymerase Chained Reaction,RFDD-PCR)技術(shù)平行操作,建立正常視網(wǎng)膜及8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜兩個基因表達譜。 2.以7%尿素變性聚丙烯酰胺電泳進行表達差異基因片段的分離顯示,結(jié)合http://www.Qgene.com/display/數(shù)據(jù)庫資料,應(yīng)用ImageTool,
3、ImageQuant TL等軟件,對各組織間有表達差異的基因進行生物信息學(xué)分析,篩選糖尿病候選基因。 3.通過半定量RT-PCR、Rea1-time RT-PCR、Western B10t、免疫組織化學(xué)技術(shù)進一步觀察候選基因在8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達。 結(jié)果: 1.建立了糖尿病大鼠視網(wǎng)膜及正常大鼠視網(wǎng)膜基因表達譜:共獲得有意義的表達片段3639個,包括DR:1826個,NR:1813個。有差異的片段840。與正常相比
4、糖尿病狀態(tài)下表達信號減弱的基因片段283個,增強的225個,消失的145個,出現(xiàn)的187個; 2.差異表達譜生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,糖尿病狀態(tài)下:1)NOS: eNOS和nNOS表達有不同程度下調(diào),iNOS表達明顯上調(diào):2) ET 及ETR: ET-1、ET-3、ETRB和ECE表達均不同程度上調(diào),ET-2和ETRA本次實驗中未能檢出;3)synuclein:α-synuclein表達明顯上調(diào),β-synuclein和γ-syn
5、uclein表達無變化。 3.半定量RT-PCR結(jié)果顯示:1)NOS:與正常視網(wǎng)膜相比,糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜eNOS和nNOS表達明顯下調(diào),iNOS表達明顯上調(diào);2)ET及ETR:與正常視網(wǎng)膜相比,糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜ET-1、ET-2、ET-3、 ETRA、ETRB和ECE表達均明顯上調(diào)。 4.Real-time RT-PCR結(jié)果顯示:與正常視網(wǎng)膜相比,8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜α-synuclein,β-synuclein
6、和γ-synuclein表達明顯上調(diào)。 5.半定量Western B1ot 結(jié)果顯示:1)3-NT和NOS:與正常視網(wǎng)膜相比,糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜eNOS和nNOS蛋白水平明顯降低,3-NT和iNOS蛋白水平明顯升高:2)ET及ETR:與正常視網(wǎng)膜相比,糖尿病8周大鼠視網(wǎng)膜ET、ETRA和ETRB蛋白水平均明顯增強;3)α-synuclein:與正常視網(wǎng)膜相比,8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜α-synuclein蛋白水平均明顯增強。
7、 6.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:1)3-NT和NOS:與正常視網(wǎng)膜相比,8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中,INL的3-NT和iNOS免疫陽性細胞明顯增多,INL和血管內(nèi)皮層的eNOS陽性細胞明顯減少,INL的nNOS陽性細胞也明顯減少;2)ET及ETR:與正常視網(wǎng)膜相比,8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中,ET、ETRA、ETRB 免疫陽性細胞明顯增多,增多的陽性細胞主要集中于INL,而在血管內(nèi)皮層增多不明顯;3)α-synuclein:與正常視網(wǎng)膜相比,8周
8、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中,α-synuclein免疫陽性細胞明顯增多,增多的陽性細胞主要集中于視網(wǎng)膜視錐視桿層。 結(jié)論: 1.RFDD-PCR 技術(shù)可以檢測出大量表達基因,適用于疾病差異表達譜分析,可以初篩疾病相關(guān)基因。 2.8周糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中,eNOS和nNOS的表達降低提示視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞和神經(jīng)細胞已受到損害,INL和GCL的3-NT免疫陽性反應(yīng)的出現(xiàn)和iNOS表達的增強進一步提示8周糖尿病大鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜
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