新發(fā)現(xiàn)的人類Boca病毒與兒科呼吸道感染相關(guān)性的初步研究.pdf

1、2005年9月，瑞典科學(xué)家Allander等人報(bào)道在人類呼吸道標(biāo)本中檢測到一種細(xì)小病毒樣核苷酸序列，所推導(dǎo)的氨基酸序列與牛細(xì)小病毒及犬微小病毒同源性較高，而與人細(xì)小病毒B19也有同源性，但是很低。由于細(xì)小病毒B19自70年代被分離、80年代被確定為病原體后，一直被認(rèn)為是已知的唯一對(duì)人類致病的細(xì)小病毒，說明這一新發(fā)現(xiàn)的病毒是一種新的對(duì)人類致病的細(xì)小病毒?，F(xiàn)在暫時(shí)將這一新發(fā)現(xiàn)病毒命名為人Boca病毒(HBoV)。但HBoV的致病性尚無定論，

2、HBoV究竟是病原還是過客？是否存在與腺病毒相關(guān)性細(xì)小病毒的無癥狀感染相似的無癥狀呼吸道感染？作為一種新近報(bào)道的病毒，HBoV是久已存在剛被發(fā)現(xiàn)，還是確實(shí)是一種新出現(xiàn)的病毒？它在人群中的流行情況如何？北京地區(qū)兒童的呼吸道感染是否與這種病毒有關(guān)？這一系列問題的回答只有依靠更多的研究、更多的資料積累。 為了了解北京地區(qū)嬰幼兒急性呼吸道感染與HBoV的關(guān)系，選擇了這一研究課題。最初選擇2003年11月至2004年10月收集的經(jīng)間接免疫

3、熒光和/或病毒分離進(jìn)行了常見呼吸道病毒檢測的急性呼吸道感染患兒標(biāo)本728例，應(yīng)用針對(duì)HBoV的NP1基因的PCR引物進(jìn)行HBoV基因片段檢測，選取HBoV基因檢測陽性標(biāo)本中的5例，對(duì)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行核苷酸序列測定。將所測到的序列與GenBank中的基因序列進(jìn)行比較分析，以確證所用方法的可靠性。所檢測的728例標(biāo)本中有17例有預(yù)期大小的基因片段擴(kuò)增，提示為HBoV陽性，其陽性檢出率占本組檢測標(biāo)本的2.3％，其中一例合并有腺病毒的感

4、染；基因序列分析表明選取的HBoV基因檢測陽性的5例北京的HBoV之間基因序列的同源性在99.7～100％之間，與ST1、ST2株的同源性為99.2～99.4％，確證有預(yù)期大小的基因片段擴(kuò)增的標(biāo)本確實(shí)是HBoV陽性；HBoV陽性檢出率在本組的毛細(xì)支氣管炎患兒中最高，達(dá)7.3％(6/82)，其次為支氣管炎(3/69，4.2％)的患兒；HBoV檢測陽性標(biāo)本的患兒年齡主要分布于5個(gè)月～5歲，尤其是<1歲的患兒中；其中8～9個(gè)月的患兒中HBoV

5、檢測陽性的占18.8％(3/16)，9～10個(gè)月的患兒中陽性的占11.8％(2/17)；在<5個(gè)月的總計(jì)211例患兒中以及>5歲的69例患兒中均未檢測到HBoV陽性標(biāo)本。這一結(jié)果提示北京地區(qū)部分兒科患者的急性呼吸道感染與HBoV有關(guān)，且HBoV感染在小年齡組兒童中更為常見。 為了了解北京地區(qū)人Boca病毒(human bocavirus，HBoV)的基因組編碼特征，并對(duì)其基因組編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、核蛋白NP—1以及病毒外殼蛋

6、白VP1及VP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)等特性進(jìn)行預(yù)測分析，從已確證為HBoV陽性的兩份臨床標(biāo)本BJ3064、BJ3722中應(yīng)用針對(duì)NS1、NP—1、VP1、VP2、基因組3’末端的引物對(duì)擴(kuò)增得到預(yù)期片段，PCR產(chǎn)物直接測序后得到基因組序列，將其上傳至GenBank；運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，對(duì)HBoVBJ3064基因組編碼的NS1、NP—1以及VP1、VP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其它生物學(xué)特性進(jìn)行了預(yù)測分析。結(jié)果顯示HBoVBJ3064及BJ3722基因組序列全

7、長分別為5299bp、5300bp，共有四個(gè)主要的CDS(coding domain sequences)，分別編碼NS1、NP—1、VP1、VP2蛋白。序列同源性比較結(jié)果顯示BJ3064與BJ3722間基因組序列的同源性達(dá)99.9％；與ST1比較，同源性為99.4—99.5％；與ST2比較，同源性為99.8％；與BPV及MVC比較，同源性低于45％；與細(xì)小病毒B19的同源性僅為5％左右；基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示BJ3064、BJ372

8、2與ST2在一簇中，ST1屬另一簇。NS1、NP—1、VP1及VP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要為無規(guī)卷曲，其他結(jié)構(gòu)如α螺旋、β片層，β轉(zhuǎn)角在不同蛋白中占有不同比例；各蛋白均無明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域；NS1、NP—1屬不穩(wěn)定蛋白，VP1、VP2屬穩(wěn)定蛋白。這一結(jié)果提示北京地區(qū)BJ3064、BJ3722基因組序列與瑞典科學(xué)家報(bào)道的原型株之間有很高的同源性；而對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析必將有益于蛋白的表達(dá)、分離純化以及蛋白檢測條件的選擇。 目前

9、為止，僅有少量的關(guān)于健康人群及急性呼吸道感染的嬰兒體內(nèi)HBoV特異性獲得性免疫的報(bào)道，主要原因在于缺乏可分離到的病毒或病毒抗原以及標(biāo)準(zhǔn)的診斷方法。本研究分別利用原核表達(dá)系統(tǒng)及真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了HBoVVP2蛋白的表達(dá)。在利用原核表達(dá)系統(tǒng)的研究中，首先從已證明為HBoV陽性的臨床標(biāo)本BJ3722中經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增得到HBoVVP2蛋白編碼區(qū)基因片段，將其克隆至pUCm-T載體中，然后再亞克隆至原核表達(dá)載體pET30b(+)，經(jīng)

10、雙酶切、PCR、序列測定等方法挑選、鑒定陽性克隆，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pET30b—VP2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在不同的溫度下利用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，再對(duì)得到的蛋白表達(dá)產(chǎn)物粗提物經(jīng)Ni2+進(jìn)行親和層析純化。通過改善表達(dá)及純化條件，得到了較大量的HBoVVP2蛋白表達(dá)；然后利用抗組氨酸抗體、兔抗HBoV—VP2多肽免疫血清、抗細(xì)小病毒B19VP2特異性抗體以及人血清進(jìn)行抗原性初步分析，初步證明表達(dá)產(chǎn)物具有抗原特異性，與細(xì)小病毒B

11、19抗體無交叉反應(yīng)。 隨后以所表達(dá)的HBoVVP2蛋白為抗原，應(yīng)用Western—blot方法，對(duì)兩組血清標(biāo)本進(jìn)行HBoVVP2蛋白特異性IgG抗體檢測以初步了解北京地區(qū)人群中這種新發(fā)現(xiàn)的病毒的感染狀況。其中一組為1996年4月至1997年3月取自首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院健康查體者及北京宣武醫(yī)院非呼吸道感染患者的血清標(biāo)本，共計(jì)677份；另一組為2005年8月收集的20-60歲健康查體者的血清標(biāo)本，共計(jì)141例。在第一組677份

12、血清標(biāo)本中，抗HBoVVP2蛋白IgG抗體陽性的400份，總檢出率為59.1％。<1個(gè)月的嬰兒抗體陽性率為45.3％，1個(gè)月～的嬰兒抗體陽性率為41.4％，2個(gè)月～的嬰兒抗體陽性率最低(31.3％)，6個(gè)月～至7歲齡～嬰幼兒抗體陽性檢出率在45.6％～69.7％，7歲后直至40歲，抗體陽性檢出率維持在70％左右；50歲后則為61.8％～62.8％；在第二組141份血清標(biāo)本中，抗HBoVVP2蛋白的IgG抗體陽性檢出率為78.7％(111

13、/141)。對(duì)兩組血清標(biāo)本進(jìn)行相應(yīng)年齡段的陽性檢出率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)2005年組的各年齡段明顯高于1996—1997年組?？赡艿脑蛑皇菢?biāo)本的凍存時(shí)間不同，但不能排除隨時(shí)間推移，感染率的增加。這一研究結(jié)果提示早在1996年北京地區(qū)的人群中就有59.1％曾經(jīng)感染過HBoV，說明這種病毒是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒而不是新出現(xiàn)的病毒，北京地區(qū)人群中該病毒的感染較常見。6月齡以前的嬰兒為易感人群。 在病毒的基礎(chǔ)研究中，VLPs可應(yīng)用于病毒形態(tài)發(fā)

14、生學(xué)、病毒的組裝與復(fù)制、病毒出芽過程等多方面的研究，為研究病毒的功能，尤其是對(duì)于缺乏動(dòng)物模型、不易于體外培養(yǎng)的病毒開辟了一個(gè)新的有效途徑；而且是目前最有前景的防治傳染病、腫瘤、以及過敏性疾病的候選疫苗。目前已發(fā)現(xiàn)有不少病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因在真核表達(dá)系統(tǒng)中能有效的組裝成病毒樣顆粒。已有研究表明在細(xì)小病毒科成員中單純的VP2蛋白即可形成病毒樣顆粒(VLPs)。 本研究首先在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了HBoV VP2蛋白的重組表達(dá)。將來源

15、于BJ3722的HBoV VP2編碼區(qū)基因克隆至桿狀病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體(pFastBacl)，通過轉(zhuǎn)座反應(yīng)，得到重組的Bacmid DNA，以此DNA轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞。收獲重組病毒進(jìn)行SDS-PAGE，通過考馬氏亮藍(lán)染色，應(yīng)用兔抗HBoVVP2高價(jià)免疫血清進(jìn)行Western—blot反應(yīng)，均可檢測到分子量約為61kDa的蛋白，表明有HBoVVP2蛋白的表達(dá)，而且所表達(dá)的蛋白具有抗原特異性。 對(duì)得到的重組病毒進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。以0.5的感染

16、復(fù)數(shù)(MOI)感染昆蟲細(xì)胞7—10天后收獲的培養(yǎng)上清，或感染4—5天后收獲的細(xì)胞，經(jīng)兩次40％的蔗糖墊超速離心，通過和特異性的免疫血清共同孵育后在電鏡下觀察病毒樣顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Western—blot檢測結(jié)果顯示經(jīng)過兩次蔗糖墊離心純化后，與純化前樣品相比，雜蛋白數(shù)量明顯減少，提示離心達(dá)到的一定的純化效果：應(yīng)用間接免疫熒光在所制備的細(xì)胞涂片上均檢測到特異性的綠色熒光細(xì)胞；蛋白成分分析顯示VLPs的成分為VP2蛋白。純化后的樣品經(jīng)與特異性

17、免疫血清共同孵育后在電鏡下可見類似于天然的細(xì)小病毒B19的空殼結(jié)構(gòu)的球形顆粒，直徑20nm左右，這一結(jié)果確認(rèn)成功構(gòu)建了HBoV的VLPs。 綜上所述，本研究對(duì)新發(fā)現(xiàn)的繼細(xì)小病毒B19之后的第二類感染人類的細(xì)小病毒科成員HBoV進(jìn)行了較為全面的系統(tǒng)性研究，完善了我國嬰幼兒急性呼吸道感染的病毒病原譜，并為急性呼吸道感染的病原診斷提供了更加完善的技術(shù)平臺(tái)；同時(shí)進(jìn)行了大量的分子病毒學(xué)研究，為進(jìn)一步的研究奠定了良好的基礎(chǔ)；而HBoV病毒樣