胃癌-樹突狀細(xì)胞融合疫苗刺激T淋巴細(xì)胞抗胃癌SGC7901細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：胃癌是臨床常見的惡性腫瘤，采用手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療手段預(yù)后仍較差。近年來，樹突狀細(xì)胞(DC)因其強(qiáng)大的抗原提呈及免疫激發(fā)能力引起人們廣泛重視。胃癌細(xì)胞缺乏特異性腫瘤抗原且抗原性弱，以往的研究手段如癌細(xì)胞凍融、超聲粉碎、癌細(xì)胞表面抗原酸洗脫等方法所能獲取的腫瘤抗原量及刺激DC激發(fā)后續(xù)抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力均較弱。為實(shí)現(xiàn)腫瘤抗原對(duì)DC的更有效刺激，提高DC抗原提呈及免疫激發(fā)能力，實(shí)現(xiàn)更有效的腫瘤生物治療效應(yīng)，由于自體瘤苗的制備時(shí)采

2、集自身DC通常會(huì)受到采集患者細(xì)胞的困難，而異體DC可以從儲(chǔ)備的健康志愿者外周血單核細(xì)胞中獲得，可避免使患者在接受免疫治療前采集自身外周血的缺陷。本實(shí)驗(yàn)將從健康人外周血富集白細(xì)胞層中獲得的單個(gè)核細(xì)胞( PBMC)所誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC與胃癌SGC7901細(xì)胞相融合，觀察細(xì)胞瘤苗刺激自體和異體T淋巴細(xì)胞的增殖性及對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞的殺傷性，希望能為胃癌DC瘤苗免疫治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)，同時(shí)也是對(duì)無償捐獻(xiàn)血液的一個(gè)合理利用，開辟了寶貴的

3、血液資源的有效利用途徑。 方法：第一部分：人外周血富集白細(xì)胞層來源的樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定。從健康人的外周血富集白細(xì)胞層中獲取貼壁細(xì)胞，利用GM-CSF、IL-4、TNF-α體外定向誘導(dǎo)分化，獲取成熟DC，并對(duì)其形態(tài)及表面標(biāo)志進(jìn)行鑒定。第二部分：胃癌SGC7901細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞融合疫苗的制備。對(duì)應(yīng)用健康志愿者的外周血白膜層分離制備DC，再與SGC7901胃癌細(xì)胞融合制備DC融合性細(xì)胞瘤苗，使用HAT/HT選擇培養(yǎng)系統(tǒng)篩選培養(yǎng)，

4、獲得純凈的融合細(xì)胞。第三部分：異體T淋巴細(xì)胞經(jīng)DC融合性細(xì)胞瘤苗刺激后的增殖性及對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞殺傷效應(yīng)的研究。MTT比色法檢測(cè)DC融合性細(xì)胞瘤苗激活同種同體和同種異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力及體外殺傷胃癌SGC7901細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。 結(jié)果：1、健康人外周血(200ml)富集白細(xì)胞層所分離、誘導(dǎo)成熟的DC，每份可以獲得(3.87±0.31)×107個(gè)成熟的DC，其表面分子表達(dá)水平可達(dá)CD83(48.54+2.12)％，C

5、Dla(50.59±5.06)％，CD86(63.04±4.42)％，HLA-DR(89.12±3.99)％。2、DC融合性細(xì)胞瘤苗具有類似于DC的懸浮生長特性，未保留親代SGC7901胃癌細(xì)胞的貼壁生長特性。DC和SGC7901胃癌細(xì)胞融合后經(jīng)光鏡觀察，可見大量體積明顯增大的融合細(xì)胞懸浮生長于培養(yǎng)基中，胞漿透明，細(xì)胞邊界清晰，胞膜完整，部分融合細(xì)胞體積巨大。經(jīng)HAT選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)2周、HT選擇培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)1周后光鏡觀察，可見細(xì)胞

6、數(shù)量明顯減少，僅剩少量體積較大、胞膜完整、呈均勻圓形懸浮生長的融合細(xì)胞存在，細(xì)胞表面未見明顯的毛刺樣突起，細(xì)胞內(nèi)有單個(gè)存在的較親代細(xì)胞明顯增大的細(xì)胞核。3、DC融合性細(xì)胞瘤苗對(duì)自體和異體T淋巴細(xì)胞的增殖能力，隨融合細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比例增加而增殖能力逐漸增加，在相同效靶比情況下，兩種T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)沒有顯著差異。DC融合性細(xì)胞瘤苗體外激活的自體和異體T淋巴細(xì)胞對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞的殺傷率沒有顯著差異。體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中，DC融合性細(xì)

7、胞瘤苗激活的兩種T淋巴細(xì)胞對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞的殺傷率均比未激活的T淋巴細(xì)胞明顯增高，其兩者間沒有明顯差異。 結(jié)論：1、健康人外周血富集白細(xì)胞層所分離出的單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)GM-CSF、IL-4和TNF-α細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng).可獲得具備典型特征及細(xì)胞表型的DC。2、胃癌細(xì)胞SGC7901細(xì)胞與DC經(jīng)PEG誘導(dǎo)融合，HAT/HT選擇培養(yǎng)，可獲得純凈融合細(xì)胞。3、融合細(xì)胞具有類似于DC的懸浮生長特性，而不保留親代SGC7901胃癌細(xì)胞