豬繁殖與呼吸綜合征病毒強(qiáng)弱毒感染豬肺泡巨噬細(xì)胞差異蛋白的篩選及驗(yàn)證.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRS virus, PRRSV）引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸障礙為特征的急性傳染病。1987年，該病在美國首次報(bào)道。2006年，中國爆發(fā)高致病性PRRS，除了經(jīng)典癥狀以外，以高致病率與高死亡率為主要特點(diǎn)。PRRSV為單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目，動(dòng)脈炎病毒科，動(dòng)脈炎病毒屬；

2、基因組在核糖體移碼框的作用下轉(zhuǎn)錄并翻譯為pp1a與pp1ab兩段多肽，并在其自身產(chǎn)生的水解酶的作用下，將這兩條多肽鏈消化產(chǎn)生多于12種非結(jié)構(gòu)蛋白，這些非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)參與結(jié)構(gòu)蛋白的合成，與此同時(shí)，產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白會(huì)一同協(xié)作，參與病毒感染宿主細(xì)胞的過程。PRRSV具有嚴(yán)格的細(xì)胞嗜性，在患豬體內(nèi)病毒主要靶細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）以及不同組織的單核巨噬細(xì)胞，不同毒力的毒株感染 PAM效率有顯著差異，導(dǎo)致這種差異的機(jī)制尚不清楚。

3、>　　本研究以高致病性PRRSV HuN4強(qiáng)毒株與其傳代致弱的HuN4-F112弱毒株為參考毒株，構(gòu)建重組EGFP-PRRSV強(qiáng)弱毒感染性克隆，感染和純化PAM，進(jìn)行定性蛋白質(zhì)譜分析；同時(shí)以其親本強(qiáng)弱毒感染宿主PAM細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行定量蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗(yàn)證與病毒相互作用PAM細(xì)胞膜差異蛋白，可揭示PRRSV不同毒力毒株感染細(xì)胞效率差異的分子基礎(chǔ)，為PRRSV致病機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。
　　為了純化和篩選與PRRSV相互作用的宿

4、主細(xì)胞膜蛋白，本研究首先分別構(gòu)建了含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的重組PRRSV強(qiáng)弱毒感染性克隆，作為指示病毒，為篩選及驗(yàn)證與PRRSV相互作用的 PAM細(xì)胞膜蛋白提供技術(shù)支撐。以 PRRSV HuN4感染性克隆以及其傳代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆為骨架，利用反向遺傳操作技術(shù)，在其病毒基因組ORF1b和ORF2a之間插入egfp基因，并在外源基因3?端下游插入該病毒的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列6（TRS6），構(gòu)建重組病毒感染性分子克隆pH

5、uN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP，并通過轉(zhuǎn)染拯救出重組病毒。在MARC-145細(xì)胞中，將重組病毒連續(xù)傳代，其外源egfp基因仍能夠持續(xù)表達(dá)，表明該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性。重組病毒在病毒滴度、噬斑形態(tài)、生長能力等方面與親本毒無明顯差異。
　　在獲得具有能夠持續(xù)表達(dá)綠色熒光蛋白的重組PRRSV強(qiáng)弱毒之后，將強(qiáng)弱毒重組病毒分別感染PAM，純化PAM，提取細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行定性蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗(yàn)證與病毒相互作用PAM

6、細(xì)胞膜差異蛋白。結(jié)果表明，在分選流式儀的FITC通道中，可獲得強(qiáng)弱重組病毒感染PAM而產(chǎn)生的綠色熒光信號(hào)，分選出重組病毒感染的PAM，獲得了純化的細(xì)胞膜蛋白，利用Shotgun方法進(jìn)行了膜蛋白定性蛋白質(zhì)譜分析，獲得的蛋白信息進(jìn)行GO注釋，并按蛋白分類分析，篩選出強(qiáng)弱毒差異蛋白93個(gè)。對(duì)選擇的5個(gè)相關(guān)蛋白進(jìn)行標(biāo)簽融合和真核上調(diào)表達(dá)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和 Kexin ty

7、pe9對(duì)強(qiáng)毒存在抑制作用，推測(cè)為抵御PRRSV感染的宿主蛋白；Clusterin isoform x1對(duì)強(qiáng)毒的感染存在上調(diào)作用，推測(cè)可能是PRRSV感染的宿主受體蛋白。
　　以其親本強(qiáng)弱毒感染宿主 PAM細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)譜分析，篩選及驗(yàn)證了與病毒相互作用PAM細(xì)胞膜差異蛋白。結(jié)果表明，通過Label-free定量蛋白質(zhì)組分析，獲得差異蛋白95個(gè)，其中確定定位在膜上26個(gè)；通過Western Blot驗(yàn)證了KDEL受體以及