超聲介導(dǎo)微泡破裂法促進(jìn)骨形成蛋白-2基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙周疾病治療的理想效果不僅在于終止病變本身,更在于促進(jìn)牙周組織的再生,從而達(dá)到牙周組織結(jié)構(gòu)與功能的完全恢復(fù)。骨形成蛋白(bonemorphogenetic proteins,BMPs)是一種具有高度骨誘導(dǎo)活性的細(xì)胞因子家族,在眾多的亞型中,骨形成蛋白-2(BMP-2)是BMPs家族中誘骨活性最強(qiáng)的一種,也是能單獨(dú)誘導(dǎo)成骨的因子,其在牙周組織再生和修復(fù)中具有重要的作用。但僅靠外源性植入,BMPs在骨損傷部位存在的時(shí)間及濃度是有限的,往往不

2、能滿足某些骨損傷修復(fù)的需要,尚不能達(dá)到牙周組織完全再生的目的?；蛑委熂夹g(shù)引入牙周病治療的研究領(lǐng)域,為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)帶來(lái)了新的希望。
　　 導(dǎo)入目的基因的途徑有體外轉(zhuǎn)移法和體內(nèi)轉(zhuǎn)移法。前者將目的基因在體外轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞,形成表達(dá)外源基因的基因修飾細(xì)胞,然后回植體內(nèi)以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng),因此體外轉(zhuǎn)移法因需細(xì)胞培養(yǎng)和篩選等而復(fù)雜；后者是將目的基因在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞,使其進(jìn)入靶細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄、表達(dá)以發(fā)揮治療作用。它不需要細(xì)胞培養(yǎng)移植,方法簡(jiǎn)便

3、、經(jīng)濟(jì)、安全,更接近臨床應(yīng)用實(shí)際。但是,體內(nèi)轉(zhuǎn)移法目前遇到的最大困難就是目的基因轉(zhuǎn)染效率低下。
　　 目前基因載體主要有病毒性載體與非病毒性載體兩類。病毒型載體是基于某些病毒自身結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)染機(jī)制而構(gòu)建的,具有轉(zhuǎn)染效率高的優(yōu)點(diǎn),但其制備復(fù)雜,而且具有高免疫原性和非導(dǎo)向性,大大限制了病毒性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的臨床應(yīng)用。非病毒性基因載體主要有質(zhì)粒載體,其轉(zhuǎn)染效率較低,需結(jié)合物理或化學(xué)方法來(lái)提高。化學(xué)法主要采用脂類、肽類、多聚體等化學(xué)物質(zhì),此類物質(zhì)

4、帶有正電荷,通過(guò)電荷偶聯(lián)作用可將攜帶負(fù)電荷的DNA導(dǎo)入細(xì)胞。但是這種技術(shù)同樣具有基因轉(zhuǎn)染部位的非特異性及活體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低的缺點(diǎn)。物理法目前研究應(yīng)用較多的為電穿孔法,電穿孔法系指使用高強(qiáng)度的電子場(chǎng)導(dǎo)致暫時(shí)性的細(xì)胞膜孔開(kāi)放,由此促使外源性的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。此法體外應(yīng)用效果較好,但其所需的高強(qiáng)度電流對(duì)組織的明顯損害,限制了其在活體組織的應(yīng)用。因此,基因治療的發(fā)展需開(kāi)發(fā)一種高效安全的基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
　　 裸質(zhì)粒直接注射法是公認(rèn)的一種

5、既簡(jiǎn)便又有效的方法,并且安全性高,被認(rèn)為是基因治療的發(fā)展方向。但是質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率較低,所以尋找提高質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的方法是目前基因治療研究的熱點(diǎn)之一。最近,國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)超聲微泡造影劑可作為一種新型的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染載體,在一定條件的超聲照射下能促進(jìn)目的基因安全而有效的定向轉(zhuǎn)移,增加外源性基因轉(zhuǎn)化率和表達(dá)水平,該方法有可能成為基因治療研究中新的突破點(diǎn)。
　　 因此在本文中,我們擬通過(guò)PCR、T/A克隆等DNA重組技術(shù),構(gòu)建含增強(qiáng)型綠

6、色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)的重組人骨形成蛋白-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)基因真核表達(dá)質(zhì)粒；通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),探討超聲介導(dǎo)微泡破裂法對(duì)目的基因轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞的影響；同時(shí),將含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組BMP-2質(zhì)粒pIRES-rhBMP2-EGFP進(jìn)行小鼠后肢骨骼肌體內(nèi)轉(zhuǎn)染,研究微泡造影劑在超聲作用下能否促進(jìn)BMP-2基因在小鼠體內(nèi)表達(dá),為

7、其介導(dǎo)的BMP2直接基因療法在組織再生中應(yīng)用的可行性提供初步實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)一含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組人骨形成蛋白-2基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 目的:采用DNA體外重組技術(shù),以質(zhì)粒pIRES為載體,構(gòu)建一含有EGFP和rhBMP-2基因的真核雙表達(dá)質(zhì)粒。
　　 方法:
　　 1.PCR擴(kuò)增rhBMP-2基因,并在兩端添加合適的酶切位點(diǎn)。
　　 2.利用定向克隆技術(shù)將rhBMP-2基因和

8、EGFP基因分別插入到載體pIRES的上下游多克隆位點(diǎn)中,兩者通過(guò)IRES連接以防止兩者融合表達(dá)。
　　 3.重組的pIRES-rhBMP2-EGFP在大腸桿菌DH5α(escherichia coli DH5α,E.coli DH5α)內(nèi)擴(kuò)增后,通過(guò)酶切電泳鑒定和DNA測(cè)序證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 結(jié)果:
　　 通過(guò)對(duì)重組質(zhì)粒pIRES-rhBMP2-EGFP進(jìn)行酶切鑒定以及DNA序列測(cè)定分析,證明真核表達(dá)重組

9、質(zhì)粒pIRES-rhBMP2-EGFP構(gòu)建成功,開(kāi)放閱讀框架正確。
　　 結(jié)論:
　　 利用PCR、T/A克隆等分子生物學(xué)技術(shù)可成功地將編碼rhBMP-2的DNA片段和EGFP片段克隆到載體pIRES中,構(gòu)建出重組子pIRES-rhBMP2-EGFP。
　　 實(shí)驗(yàn)二超聲介導(dǎo)微泡破裂法促進(jìn)骨形成蛋白-2基因在NIH3T3細(xì)胞中的表達(dá)
　　 目的:以小鼠NIH3T3為載體細(xì)胞,探討超聲介導(dǎo)微泡破裂法促進(jìn)體外細(xì)

10、胞基因轉(zhuǎn)染效率,為超聲微泡破裂法在體內(nèi)組織再生中的應(yīng)用提供可行性。
　　 方法:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇NIH3T3細(xì)胞并傳代3到4次,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后接種至六孔培養(yǎng)板。
　　 2.質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染:六孔板中細(xì)胞隨機(jī)分為兩組,分別采用質(zhì)粒DNA+脂質(zhì)體法(D+LF組)和質(zhì)粒DNA+超聲+微泡法(D+U+M組)轉(zhuǎn)染目的基因。
　　 3.檢測(cè)項(xiàng)目與觀察指標(biāo):轉(zhuǎn)染24～48h后對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行熒光顯微鏡

11、下計(jì)數(shù)以計(jì)算轉(zhuǎn)染效率,并進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)以測(cè)定轉(zhuǎn)染后hBMP-2蛋白濃度。
　　 4.使用SPSS11.5軟件包分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果:采用t檢驗(yàn)對(duì)兩組轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行分析,采用曲線擬合和t檢驗(yàn)對(duì)ELISA結(jié)果進(jìn)行分析,P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 脂質(zhì)體組的轉(zhuǎn)染效率為7.30±1.58％,超聲介導(dǎo)微泡破裂組為11.77±

12、3.16％(P<0.05):脂質(zhì)體組的轉(zhuǎn)染后hBMP-2蛋白濃度為1164.35±724.67pg/ml,超聲介導(dǎo)微泡破裂組為2932.70±656.27pg/ml。超聲介導(dǎo)微泡破裂組對(duì)轉(zhuǎn)染率和hBMP-2蛋白濃度均顯著高于脂質(zhì)體組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 超聲介導(dǎo)微泡破裂法可以明顯提高外源性基因rhBMP-2在體外NIH3T3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率和蛋白濃度,可以為牙周再生基因治療提供一種新型基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。

13、r>　　 實(shí)驗(yàn)三超聲微泡破裂法促進(jìn)骨形成蛋白-2在小鼠骨骼肌中的表達(dá)
　　 目的:采用超聲微泡破裂法將含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的重組BMP-2質(zhì)粒pIRES-rhBMP2-EGFP進(jìn)行小鼠后肢骨骼肌體內(nèi)轉(zhuǎn)染,研究微泡造影劑在超聲作用下能否促進(jìn)BMP-2基因在小鼠體內(nèi)表達(dá),有助于確定借助超聲微泡破裂法進(jìn)行BMP2基因治療的可行性,并為其介導(dǎo)的BMP2直接基因療法在牙周組織再生中的應(yīng)用提供初步理論依據(jù)。
　　 方法:
　

14、　 1、24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組6只:
　　 A組:在小鼠右側(cè)脛前肌注射注入質(zhì)粒與生理鹽水的混合溶液(含質(zhì)粒30μg)；
　　 B組:在小鼠右側(cè)脛前肌注入質(zhì)粒與超聲微泡造影劑混合溶液(含質(zhì)粒30μg)后立即用超聲輻照；
　　 C組:在小鼠右側(cè)股四頭肌注入質(zhì)粒與生理鹽水的混合溶液(含質(zhì)粒100μg)；
　　 D組:在小鼠右側(cè)股四頭肌注入質(zhì)粒與超聲微泡造影劑混合溶液(含質(zhì)粒100μg)后立即

15、用超聲輻照。
　　 2、7天后處死A組和B組取小鼠脛前肌觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況。14天后處死C組和D組取小鼠股四頭肌免疫組化檢測(cè)rhBMP2表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 7天后B組綠色熒光陽(yáng)性肌纖維百分率高于A組；14天后,C組和D組都可檢測(cè)到rhBMP2的表達(dá),但D組BMP-2表達(dá)量多于C組。
　　 結(jié)論:
　　 超聲介導(dǎo)微泡破裂法能增加外源性rhBMP-2基因在小鼠體內(nèi)骨骼肌轉(zhuǎn)化率和表達(dá)