miR-155對A549細胞Weel表達調(diào)控的研究.pdf

1、第三軍醫(yī)大學博士學位論文miR155對A549細胞Weel表達調(diào)控的研究姓名：曹學武申請學位級別：博士專業(yè)：腫瘤學指導教師：陳正堂20080501第三軍醫(yī)人學博十學位論文miR155影響NsCLC患者預后的機制目前尚未明了。Yoshida等報道用免疫組化的方法觀察到約2／3的NSCLC患者Weel表達缺失，Weel表達的減少與患者預后不良及高復發(fā)率相關。同時這些weel表達缺失的腫瘤細胞增殖能力顯著增強。還發(fā)現(xiàn)，weel蛋白表達水平不是

2、在DNA水平被調(diào)控，而可能是通過其它機制被調(diào)控。miR一155對weel表達的影響尚未見報道。結合文獻，我們用生物信息學的方法對miR一155和weelmRNA3’uTR的相互作用進行了初步預測，推測weelmRNA為miR一155的靶mRNA，miR一155可能通過影響NSCLC紐胞的Weel表達進而影響患者NSCLC的預后。研究目的觀察成熟miR一155在NSCLc的表達，探討miR一155對A549細胞w的lmRNA和蛋白表達的調(diào)

3、控及其意義。實驗方法l、觀察成熟miR一155在肺腺癌、肺鱗癌、A549細胞和H157細胞的表達水平：采用Ambion公司的nlirVanaTMmiRNAIs01ationKit提取成熟miRNAs，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。采用Ambion公司的mifVanaTMqImPCRmiRNADetectionKit、mirVanaTMqR，rPCRPrimerSet、SuperTaqTMThermostableDNAPolymerase

4、和IDT公司合成的標準成熟miR一155模板，進行絕對實時定量RTPCR，測定肺腺癌、肺鱗癌、相應癌旁正常組織、A549細胞和H157細胞中成熟miR155的表達水平。2、采用TargetScan、miRanda和PicTar方法預測miR一155與WeelmRNA3’一UTR的互補結合位點，mFOLD法測算互補結合位點5’和3’端70個核苷酸的自由能△G。3、觀察miR一155對A549細胞weelmRNA表達水平的影響：采用特異性的

5、miR155抑制劑AMOs抑制A549細胞內(nèi)成熟miR一155的活性，以GAPDHmRNA為內(nèi)參，采用相對實時定量RTPCR法測定weelmRNA表達水平。4、觀察miR一155對A549細胞w色e1蛋白和Phospho—cdc2(T”15)蛋白表達水平的影響：采用特異性的miR一155抑制劑AMOs抑制A549細胞內(nèi)成熟miR一155的活性，以組蛋白H3為內(nèi)參，采用W色stemblot測定Weel蛋白和Phospho—cdc2(Tyr