下調(diào)miR-155的表達(dá)對人A549-DDP細(xì)胞株順鉑耐藥性的影響及機(jī)制.pdf

1、目的：肺癌已成為全球范圍內(nèi)發(fā)病率與病死率均居首位的惡性腫瘤?；熓沁M(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌重要的治療手段，但是臨床上常常由于癌細(xì)胞對藥物耐藥導(dǎo)致化療失敗。近來研究表明非蛋白編碼小分子 RNA(miRNA)能通過基因突變、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)靶基因及增殖凋亡相關(guān)基因影響肺癌的發(fā)生發(fā)展及藥物的敏感性。miR-155作為miRNA家族中的一種，大量研究也證實其參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與耐藥,但miR-155在肺癌中所擔(dān)當(dāng)?shù)慕巧坝绊懛伟┑南嚓P(guān)機(jī)制仍存在

2、爭議。本研究通過觀察 miR-155在 A549及其耐藥細(xì)胞株 A549/DDP中的表達(dá)差異，探究其對肺癌細(xì)胞及順鉑敏感性的影響及機(jī)制，為耐藥型肺腺癌的個體化治療提供新的思路。
　　方法：⑴細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌 A549、A549/DDP細(xì)胞株在RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清及1%青鏈霉素混合液）中生長，并放于具有適宜條件的細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37℃，5%CO2，飽和濕度）。⑵耐藥株的鑒定及miR-155及 TP53INP

3、1mRNA表達(dá)差異的檢測:MTT法檢測A549/DDP及A549兩個細(xì)胞株對順鉑的IC50，計算耐藥倍數(shù)；分別提取兩種細(xì)胞的總RNA,并進(jìn)行質(zhì)檢,采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測A549/DDP細(xì)胞株及A549細(xì)胞株中miR-155及 TP53INP1mRNA的表達(dá)差異，實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct進(jìn)行分析。⑶A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將實驗分為抑制劑組（miR155-inhibitor轉(zhuǎn)染組），空轉(zhuǎn)染組(NC-inhibito

4、r轉(zhuǎn)染組)和未轉(zhuǎn)染組。將FAM標(biāo)記的miR155抑制物（FAM-miR155-inhibitor）或FAM標(biāo)記的陰性對照鏈(FAM-NC-inhibitor)和Lipofectamine2000混合后轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞株。⑷指標(biāo)檢測：qRT-PCR檢測A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染抑制劑前后的miR-155表達(dá)情況；qRT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后預(yù)測靶基因TP53INP1及其蛋白的表達(dá)情況；

5、Western-blot技術(shù)檢測A549/DDP細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)變化；MTT實驗及流式細(xì)胞術(shù)檢測miR155-inhibitor轉(zhuǎn)染后A549/DDP對順鉑敏感性、增殖能力及凋亡的變化。⑸統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，多組間比較用單因素方差分析，應(yīng)用logistic回歸模型計算半數(shù)抑制濃度（50% Inhibitory Concentration，IC50）值

6、，以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：②順鉑對A549和A549/DDP細(xì)胞的IC50分別為16.20±2.27μmol/L、69.72±4.83μmol/L，A549/DDP的IC50值是A549的4.3倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.36，P=0.001）。②qRT-PCR結(jié)果結(jié)果顯示miR155在A549/DDP細(xì)胞中高表達(dá)，約是A549細(xì)胞的8.93倍，TP53INP1 mRNA則在其中低表達(dá),差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（

7、分別為t=37.30，P=0.001;t=5.418,P=0.006）。③miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，qRT-PCR結(jié)果顯示A549/DDP細(xì)胞株中miR-155的表達(dá)量較空載體轉(zhuǎn)染組下調(diào)了57.37%。④qRT-PCR和Western-blot結(jié)果顯示，miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染 A549/DDP細(xì)胞使miR155表達(dá)下調(diào)后，其 TP53INP1 mRNA及其蛋白表達(dá)水平較空載體轉(zhuǎn)染組顯著上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（

8、P=0.007和P=0.001）。miR155和TP53INP1在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。⑤MTT檢測結(jié)果表明，miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，順鉑對其的IC50值（29.35±3.69μmol/L）明顯高于未轉(zhuǎn)染組（70.59±3.47μmol/L）和空轉(zhuǎn)染組（74.18±6.56μmol/L），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001和P=0.001）。⑥miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染 A549/DDP細(xì)胞后，相對于未轉(zhuǎn)染組

9、和空轉(zhuǎn)染組，凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（所有P=0.001）。⑦流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞后，未轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組和抑制劑組的早期凋亡率分別為（15.77±2.89）%、（15.58±3.19）%、（32.16±3.59）%；晚期凋亡率分別為（17.33±2.12）%、（18.37±1.73）%、（29.24±2.28）%；總凋亡率分別為（33.1±

10、2.38）%、（33.95±2.31）%、（61.4±2.65）%。抑制劑組的早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率與未轉(zhuǎn)染組和空轉(zhuǎn)染組相比均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（所有P=0.001）。
　　結(jié)論：miR-155高表達(dá)于肺腺癌耐順鉑A549/DDP細(xì)胞株，參與肺癌順鉑耐藥的產(chǎn)生。下調(diào) A549/DDP細(xì)胞株中 miR-155的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)其對順鉑的耐藥性、促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能是通過靶向負(fù)調(diào)控 TP53INP1基因和/或通過其他途徑