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文檔簡(jiǎn)介
1、皮膚組織缺損在臨床上十分常見(jiàn),一般由各種急、慢性致傷因素,如機(jī)械損傷、燒傷、體表腫瘤切除、慢性潰瘍等導(dǎo)致。創(chuàng)面愈合是在多種細(xì)胞及細(xì)胞因子共同參與下完成的復(fù)雜病理生理過(guò)程,主要涉及炎癥反應(yīng)、創(chuàng)面上皮化及收縮、膠原沉積及重塑這三個(gè)過(guò)程,而這三個(gè)過(guò)程是相互影響及相互調(diào)控的。嚴(yán)重創(chuàng)面愈合后往往膠原過(guò)度沉積,導(dǎo)致纖維化及疤痕形成,如何在促進(jìn)創(chuàng)面愈合的同時(shí)減輕愈后纖維化程度一直是燒傷及各學(xué)科研究的熱點(diǎn),然而目前仍無(wú)理想結(jié)果。因此,探索新的促創(chuàng)面愈合
2、、減輕愈后纖維化程度的途徑,是急需解決的重大臨床問(wèn)題之一。
microRNA是一類短鏈非編碼RNA,通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)來(lái)發(fā)揮功能,在創(chuàng)面愈合及纖維化疾病中發(fā)揮重要作用。miR-203及miR-210分別通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移及增殖來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合,而miR-99及miR-200家族則可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞遷移而延緩創(chuàng)面愈合。miR-155早期研究主要集中在免疫領(lǐng)域,并發(fā)現(xiàn) miR-155在炎性細(xì)胞發(fā)育及免疫反應(yīng)調(diào)控中發(fā)揮重
3、要作用,近期研究還發(fā)現(xiàn) miR-155可以通過(guò)促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移。因此,我們猜測(cè) miR-155可以通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,并可以通過(guò)調(diào)控創(chuàng)面炎性細(xì)胞功能而影響創(chuàng)面愈合后纖維化程度,在創(chuàng)面愈合及創(chuàng)面愈后纖維化中發(fā)揮重要作用。
本研究擬通過(guò)創(chuàng)面局部注射 miR-155 plasmid及 antagomir來(lái)調(diào)控創(chuàng)面局部miR-155水平,在體內(nèi)觀察miR-155在創(chuàng)面愈合及愈合后纖維化中的作用,以
4、及體外細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證,并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行研究。
方法:
1、在SD大鼠背部造成1×1 cm全層皮膚缺損模型,創(chuàng)面局部注射 miR-155 plasmid后觀察其對(duì)創(chuàng)面愈合及上皮化速度的影響;成纖維細(xì)胞三維凝膠收縮實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)外α-SMA染色觀察miR-155 plasmid對(duì)創(chuàng)面收縮的影響。
2、采用角質(zhì)形成細(xì)胞劃痕及Transwell細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察miR-155對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的影響;采用Ki-67
5、染色、MTT生長(zhǎng)曲線測(cè)定及流式細(xì)胞周期檢測(cè)的方法來(lái)觀察miR-155 plasmid對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響。
3、通過(guò)F-actin、E-cadherin、β-catenin、MMPs、TIMPs等與細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的檢測(cè)來(lái)探討miR-155 plasmid促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的可能分子機(jī)制。
4、SD大鼠創(chuàng)面病理染色觀察miR-155 plasmid對(duì)創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量的影響;通過(guò)愈后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積水平檢測(cè)來(lái)觀
6、察 miR-155 plasmid對(duì)創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。
5、在C57小鼠背部全層皮膚缺損模型中注射miR-155 antagomir并觀察其對(duì)創(chuàng)面愈合速度影響;通過(guò)創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞HE及免疫組化染色、炎性因子水平測(cè)定來(lái)觀察創(chuàng)面局部注射miR-155 antagomir對(duì)創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞功能的影響。
6、通過(guò)檢測(cè)創(chuàng)面愈合后局部Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量、Masson膠原染色來(lái)觀察miR-155 antagomir局部注射
7、對(duì)C57小鼠背部創(chuàng)面愈后纖維化程度的影響。
結(jié)果:
1、SD大鼠背部全層皮膚缺損模型中,創(chuàng)面局部注射miR-155 plasmid能使創(chuàng)面局部 miR-155水平與對(duì)照組相比顯著升高,并且創(chuàng)面愈合速度明顯加快,病理染色顯示miR-155可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面上皮化;miR-155對(duì)成纖維細(xì)胞三維凝膠收縮、體內(nèi)外成纖維細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響。結(jié)果提示miR-155可以通過(guò)加速創(chuàng)面上皮化而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,對(duì)創(chuàng)面收縮無(wú)
8、明顯影響。
2、細(xì)胞劃痕及Transwell細(xì)胞穿膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-155可以促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移;miR-155對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞Ki-67表達(dá)、生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞周期等都無(wú)明顯影響。提示miR-155在促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移的同時(shí)對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響。
3、Western blot及免疫組化/熒光染色顯示 miR-155對(duì) E-cadherin、β-catenin、F-actin、MMP-9等蛋白表達(dá)均無(wú)明顯影響;
9、miR-155能引起MMP-2蛋白表達(dá)升高,并且MMP-2特異性抑制劑ARP101能部分抑制miR-155誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快,提示MMP-2在miR-155誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快及創(chuàng)面愈合加快中發(fā)揮重要作用,并且還有其他機(jī)制參與miR-155誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移增快。
4、SD大鼠皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 plasmid局部注射能增加創(chuàng)面中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量,創(chuàng)面愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原沉積量也明顯增加。提示miR-155
10、能增強(qiáng)創(chuàng)面局部炎性細(xì)胞數(shù)量并導(dǎo)致愈后纖維化程度加劇。
5、C57小鼠背部皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 antagomir局部注射能顯著降低創(chuàng)面局部miR-155水平,創(chuàng)面局部中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量顯著減少,同時(shí)促炎因子TNF-α、IL-β水平顯著降低、抑炎因子IL-10水平顯著增加;與對(duì)照組相比miR-155 antagomir局部注射對(duì)創(chuàng)面愈合速度無(wú)明顯影響。結(jié)果提示創(chuàng)面局部低表達(dá) miR-155可以調(diào)控創(chuàng)面炎性細(xì)胞功能
11、但對(duì)創(chuàng)面愈合速度無(wú)明顯影響。
6、C57小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面miR-155 antagomir局部注射愈合后Ⅰ/Ⅲ膠原、α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低,Masson膠原染色提示局部膠原排列更整齊、稀疏,表明miR-155 antagomir可以減輕創(chuàng)面愈后纖維化程度,提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量。
結(jié)論:
創(chuàng)面局部高表達(dá) miR-155能夠通過(guò)促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞遷移加速創(chuàng)面上皮化而促進(jìn)創(chuàng)面愈合,MMP-2在miR-155
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