雞巨噬細(xì)胞在LPS和小鼠紅細(xì)胞刺激下體外分化成熟的特征.pdf

1、巨噬細(xì)胞是一種重要的免疫細(xì)胞，它在殺滅病原體，遞呈抗原和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，關(guān)于雞巨噬細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)鮮有報(bào)道。本次研究使用細(xì)胞系L929和HD-11細(xì)胞系的細(xì)胞上清液刺激骨髓來源和外周血來源的巨噬細(xì)胞，首先通過多組交叉實(shí)驗(yàn)，以前體細(xì)胞的濃度、刺激因子的終濃度、以及培養(yǎng)的時(shí)間作為變量，優(yōu)化篩選出最優(yōu)的巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)的條件。在最優(yōu)條件下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，待其到達(dá)最優(yōu)培養(yǎng)天數(shù)后，通過核染實(shí)驗(yàn)以及小鼠紅細(xì)胞（mRC）

2、吞噬實(shí)驗(yàn)觀察它們的形態(tài)學(xué)特征和吞噬功能，通過普通PCR檢測了表面標(biāo)志CD11b的特異性基因，并將所得序列進(jìn)行比對。最后，將活化的巨噬細(xì)胞分別與LPS和小鼠的紅細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，使用熒光定量PCR的方法檢測特征性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、iNOS、TGF-β、TNF-α）基因的轉(zhuǎn)錄水平以及免疫分子（MHCI-α、MHCII-β、Ii）基因的轉(zhuǎn)錄水平。
　　結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：前體細(xì)胞

3、的初始濃度為6×105個(gè)/mL、刺激因子HD-11-CM和L929-CM的終濃度為30％，以及巨噬細(xì)胞的最優(yōu)培養(yǎng)天數(shù)為5~8天。在最優(yōu)條件下得到的活化的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)出梭形、細(xì)胞核增大、具有吞噬功能的特征。此外，這些細(xì)胞高水平轉(zhuǎn)錄特征性基因cd11b。結(jié)果顯示，與對照組相比，在受到兩種不同的刺激劑刺激而產(chǎn)生極化的巨噬細(xì)胞的Mhc和Ii基因的轉(zhuǎn)錄量顯著降低（P<0.01）。在LPS的刺激下體外培養(yǎng)所得的四組細(xì)胞均向M1方向進(jìn)行極化，表現(xiàn)為巨

4、噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄M1特征細(xì)胞因子IL-12、IL-6、IL-2和 iNOS的水平升高顯著（P<0.01），TNF-ɑ升高（P<0.01），但I(xiàn)L-1β表達(dá)量下降（P<0.05）；同時(shí)M2型特征細(xì)胞因子IL-10轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（P<0.01），而TGF-β轉(zhuǎn)錄水平明顯升高（P<0.01）。小鼠紅細(xì)胞刺激極化的成熟骨髓源巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄M1型特征性細(xì)胞因子IL-12顯著升高（P<0.01），IL-6、IL-2的升高（P<0.05），而IL-1β、i

5、NOS、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平則顯著下降（P<0.01），M2型特征性細(xì)胞因子L-10和TGF-β轉(zhuǎn)錄水平也顯著下降（P<0.01）。這些結(jié)果不僅提供了雞巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)的生物學(xué)特征，而且表明了刺激劑影響巨噬細(xì)胞體外極化的作用。
　　綜上所述，本次研究建立了血液源和雞骨髓源巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)極化的方法。通過在形態(tài)學(xué)、功能學(xué)以及分子水平的檢測證明培養(yǎng)所得的四種細(xì)胞（L929-CM刺激的骨髓源巨噬細(xì)胞、L929-CM刺激的血液源巨噬細(xì)胞