二磷酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化成熟的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:二磷酸鹽問(wèn)世至今已經(jīng)有近140年的歷史,是一種人工合成的,代謝穩(wěn)定的無(wú)機(jī)焦磷酸鹽類似物.它由焦磷酸鹽中的P-O-P鍵被不水解的P-c-P鍵代替而形成.P-O-P和P-c-P的分子構(gòu)型決定了其三維結(jié)構(gòu)能與Ca<'2+>等二價(jià)離子結(jié)合,這是二磷酸鹽骨靶向作用特性的基礎(chǔ).目前,二磷酸鹽已經(jīng)發(fā)展到第三代,廣泛應(yīng)用于骨吸收增加性疾病(如:骨質(zhì)疏松、瘤源性骨病、Paget病等、高鈣血癥等)的治療,尤其是骨質(zhì)疏松和骨腫瘤的治療. 二

2、磷酸鹽一般分為兩類:非含氮類二磷酸鹽和含氮類二磷酸鹽.非含氮類二磷酸鹽在體內(nèi)代謝成不水解的ATP類似物,這些具有細(xì)胞毒性的ATP類似物在細(xì)胞內(nèi)積聚,抑制破骨細(xì)胞功能,誘導(dǎo)其凋亡.含氮類二磷酸鹽則通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)甲羥戊酸途徑發(fā)揮作用,其機(jī)制是選擇性抑制焦磷酸法呢酯合成酶,引起焦磷酸法呢酯(FPP)和焦磷酸二牛龍牛兒酯((3GPP)合成減少,從而阻礙了小GTP酶的異戊烯化,導(dǎo)致破骨細(xì)胞喪失皺褶緣,干擾肌動(dòng)蛋白環(huán)形成和質(zhì)子泵的泌H<'+>功能,

3、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. 一個(gè)通常的誤解認(rèn)為二磷酸鹽的作用機(jī)理只特異性針對(duì)破骨細(xì)胞.現(xiàn)在越來(lái)越多的研究表明二磷酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞也起作用.研究發(fā)現(xiàn):二磷酸鹽除能抑制人的成骨細(xì)胞系凋亡,還能抑制鼠的骨細(xì)胞系和成骨細(xì)胞系的凋亡;阿倫磷酸和伊替磷酸增強(qiáng)IL-6在成骨細(xì)胞中的表達(dá);在對(duì)犬的全髖置換模型中發(fā)現(xiàn),二磷酸鹽除了能抑制磨損碎屑引起的骨質(zhì)溶解,還使髖臼假體植入孔內(nèi)的礦化骨量增加了115﹪.這些研究結(jié)果反映了二磷酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞可能具有直接的合成作

4、用. 然而,目前就二磷酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞的作用仍然存在著眾多分歧.有研究者發(fā)現(xiàn)阿倫磷酸能增加成骨細(xì)胞及成骨前體細(xì)胞的數(shù)量;而另有研究者則認(rèn)為阿倫磷酸無(wú)此作用.一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道了高濃度的二磷酸鹽能抑制成骨細(xì)胞增殖,導(dǎo)致骨礦化受損;而另一些實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)高濃度的二磷酸鹽能影響細(xì)胞增殖,并促進(jìn)I型膠原、堿性磷酸酶、骨橋蛋白及骨涎蛋白在成骨細(xì)胞中的表達(dá). 由此可見(jiàn),各種二磷酸鹽究竟具體對(duì)成骨細(xì)胞起什么樣的作用,作用的機(jī)理是什么,何種濃度為

5、最佳濃度,都還不甚清楚.研究目的在本次實(shí)驗(yàn)中我們將分析證實(shí)二磷酸鹽對(duì)成骨細(xì)胞增殖及分化成熟的作用,并進(jìn)一步探討二磷酸鹽在何種濃度下發(fā)揮其最大效能. 材料與方法:人成骨樣MG一63細(xì)胞以4*10<'5>/cm<'2>接種于H-DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含10﹪胎牛血清,10mM β-磷酸甘油,50ng/ml L-抗壞血酸)中,于37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度孵箱內(nèi)孵育. 每3-4天細(xì)胞長(zhǎng)滿單層,用0.25﹪胰蛋白酶消化傳代.傳

6、代后,將MG-63細(xì)胞分為5組:第一組為空白對(duì)照組,不加誘導(dǎo)劑,常規(guī)培養(yǎng);第二組為陽(yáng)性對(duì)照組,加入10<'-8>M地塞米松;第三、四、五組為實(shí)驗(yàn)組,分別加入10<'-6>M、10<'-8>M、10<'-10>M阿倫磷酸.培養(yǎng)數(shù)日后,行TMTT、堿性磷酸酶(ALP)活性、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、von kossa'S染色等檢測(cè). 采用SPSS11.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用on

7、e-way ANOVA和雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以P(0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn). 結(jié)果: 阿倫磷酸較對(duì)照組顯著增加MG-63細(xì)胞數(shù)目,其峰值出現(xiàn)在濃度為10<'-8>M:同時(shí),阿倫磷酸使ALP活性增強(qiáng),而且上調(diào)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、骨鈣素(OC)、I型膠原(Coll.l)等成骨細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá),刺激礦化的形成. 結(jié)論: 1.阿倫磷酸刺激成骨樣MG-63細(xì)胞增殖,顯著增加MG-63細(xì)胞數(shù)目.