重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)EB病毒潛伏期膜蛋白治療鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國(guó)南方的常見(jiàn)腫瘤。EB病毒 (Epstein Barr virus，EBV)是鼻咽癌最重要的病因。鼻咽癌的組織中有EB 病毒潛伏期膜蛋白1、2不同程度的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，很少的EB病毒攜帶者能產(chǎn)生LMP1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (cytotoxic T lymphocyte，CTL)，這提示我們建立一個(gè)針對(duì)LMP1和LMP2的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)

2、，對(duì)鼻咽癌患者應(yīng)該有長(zhǎng)期的治療效果。腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus，AAV)是目前最常用的基因治療載體，它擁有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：可以攜帶基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞、無(wú)致病性、能驅(qū)動(dòng)基因在體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)。在本研究中，我們利用腺相關(guān)病毒載體，以EB病毒潛伏期膜蛋白1、2的基因作為表位，并融合了熱休克蛋白作為佐劑，構(gòu)建了一種鼻咽癌疫苗。
　　 方法：1. 我們首先克隆了EB病毒LMP1、LMP2基因的

3、編碼序列，并構(gòu)建pAAV-LMP2/1-hsp重組質(zhì)粒，然后與重組腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pXX2，輔助質(zhì)粒phelper，通過(guò)磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝制備rAAV-LMP2/1-hsp病毒，同時(shí)包裝制備對(duì)照病毒rAAV-GFP，病毒經(jīng)純化后以斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)其病毒滴度。2. SP2/0細(xì)胞轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1-LMP2質(zhì)粒，然后通過(guò)G418(400ug/ml)篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)LMP2的陽(yáng)性細(xì)胞株SP 2/0-LMP2。3. L

4、MP2228-242 肽注射于新西蘭白兔的皮下，6周后，收集血清、純化后得到兔抗LMP2多克隆抗體。4. 為確認(rèn)rAAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞后嵌合基因是否有表達(dá)，我們用1×109的病毒顆粒感染293細(xì)胞，2天后提取蛋白，通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)嵌合基因的表達(dá)。5. 我們采用了兩個(gè)不同的免疫策略。第一種方法：首先肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp 或rAAV GFP免疫BALB/c小鼠。3周后，動(dòng)物皮下注射SP2/0-LMP2 或 SP2/0細(xì)胞成瘤，

5、觀察30天，定期測(cè)量腫瘤直徑。第二種方法：首先BALB/c小鼠皮下注射SP2/0-LMP2 或 SP2/0細(xì)胞，10天后肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp 或rAAV GFP免疫動(dòng)物，定期測(cè)量腫瘤直徑。6. 為分析rAAV疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng)，BALB/c小鼠分為3組，分別肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP或PBS，3周后殺死動(dòng)物，取脾細(xì)胞。SP2/0-LMP2或SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，

6、以LDH釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能。7. 為研究rAAV疫苗的免疫機(jī)制，我們把BALB/c小鼠分為3組，分別肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP或PBS。3周后殺死動(dòng)物，取脾細(xì)胞，分別以LMP2特異性表位肽或非特異性肽干預(yù)，培養(yǎng)4天后，以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖。
　　 結(jié)果：1. 經(jīng)過(guò)酶切鑒定、PCR、測(cè)序法證實(shí)重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-LMP2/1-hsp構(gòu)建成功。2.免疫印跡法證實(shí)該病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞

7、后可表達(dá)融合蛋白。3. 先用 rAAV LMP2/1-hsp 或 rAAV GFP免疫 BALB/c小鼠，然后接種 SP2/0 或SP2/0-LMP2細(xì)胞，雖然各組都能成瘤，但是rAAV-LMP2/1-hsp組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯比其他各組緩慢，而其他各組之間無(wú)差異。第35天，rAAV LMP2/1-hsp免疫組的腫瘤體積大約是rAAV GFP免疫組的1/5。4. 先接種 SP2/0 或SP2/0-LMP2細(xì)胞，然后用 rAAV LMP2

8、/1-hsp 或 rAAV GFP免疫 BALB/c小鼠。rAAV-GFP免疫組的小鼠腫瘤進(jìn)展迅速，在免疫的第20天全部死亡；而rAAV LMP2/1-hsp免疫組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢，生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。5. BALB/c小鼠接種rAAV-LMP2/1-hsp，rAAV-GFP或生理鹽水，3周后殺死動(dòng)物，分離培養(yǎng)脾細(xì)胞。用SP2/0-LMP2或SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞，小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，以LDH釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能，結(jié)果顯示

9、rAAV-LMP2/1-hsp免疫組的脾細(xì)胞在LMP2表位肽的刺激下裂解SP2/0-LMP2和SP2/0細(xì)胞，而其他各組不發(fā)生裂解。6. 以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖反應(yīng)，結(jié)果顯示來(lái)源于rAAV-E7CTL-hsp免疫組的小鼠T細(xì)胞在LMP2表位肽的刺激作用下發(fā)生增值，而其他組T細(xì)胞不增值。
　　 結(jié)論：利用腺相關(guān)病毒載體成功構(gòu)建了一種鼻咽癌疫苗，以EB病毒潛伏期膜蛋白1、2的基因作為表位，并融合了熱休克蛋白作為佐劑，該疫苗可能通過(guò)