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1、背景和目的:鼻咽癌 (nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我國(guó)南方的常見(jiàn)腫瘤。EB病毒 (Epstein Barr virus,EBV)是鼻咽癌最重要的病因。鼻咽癌的組織中有EB 病毒潛伏期膜蛋白1、2不同程度的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),很少的EB病毒攜帶者能產(chǎn)生LMP1特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (cytotoxic T lymphocyte,CTL),這提示我們建立一個(gè)針對(duì)LMP1和LMP2的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)
2、,對(duì)鼻咽癌患者應(yīng)該有長(zhǎng)期的治療效果。腺相關(guān)病毒 (adeno-associated virus,AAV)是目前最常用的基因治療載體,它擁有一些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn):可以攜帶基因轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期細(xì)胞、無(wú)致病性、能驅(qū)動(dòng)基因在體內(nèi)長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)。在本研究中,我們利用腺相關(guān)病毒載體,以EB病毒潛伏期膜蛋白1、2的基因作為表位,并融合了熱休克蛋白作為佐劑,構(gòu)建了一種鼻咽癌疫苗。
方法:1. 我們首先克隆了EB病毒LMP1、LMP2基因的
3、編碼序列,并構(gòu)建pAAV-LMP2/1-hsp重組質(zhì)粒,然后與重組腺相關(guān)病毒包裝質(zhì)粒pXX2,輔助質(zhì)粒phelper,通過(guò)磷酸鈣沉淀法共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,包裝制備rAAV-LMP2/1-hsp病毒,同時(shí)包裝制備對(duì)照病毒rAAV-GFP,病毒經(jīng)純化后以斑點(diǎn)雜交方法檢測(cè)其病毒滴度。2. SP2/0細(xì)胞轉(zhuǎn)染了pCDNA3.1-LMP2質(zhì)粒,然后通過(guò)G418(400ug/ml)篩選,得到穩(wěn)定表達(dá)LMP2的陽(yáng)性細(xì)胞株SP 2/0-LMP2。3. L
4、MP2228-242 肽注射于新西蘭白兔的皮下,6周后,收集血清、純化后得到兔抗LMP2多克隆抗體。4. 為確認(rèn)rAAV轉(zhuǎn)染細(xì)胞后嵌合基因是否有表達(dá),我們用1×109的病毒顆粒感染293細(xì)胞,2天后提取蛋白,通過(guò)免疫印跡法檢測(cè)嵌合基因的表達(dá)。5. 我們采用了兩個(gè)不同的免疫策略。第一種方法:首先肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp 或rAAV GFP免疫BALB/c小鼠。3周后,動(dòng)物皮下注射SP2/0-LMP2 或 SP2/0細(xì)胞成瘤,
5、觀察30天,定期測(cè)量腫瘤直徑。第二種方法:首先BALB/c小鼠皮下注射SP2/0-LMP2 或 SP2/0細(xì)胞,10天后肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp 或rAAV GFP免疫動(dòng)物,定期測(cè)量腫瘤直徑。6. 為分析rAAV疫苗的細(xì)胞免疫反應(yīng),BALB/c小鼠分為3組,分別肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP或PBS,3周后殺死動(dòng)物,取脾細(xì)胞。SP2/0-LMP2或SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞,小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,
6、以LDH釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能。7. 為研究rAAV疫苗的免疫機(jī)制,我們把BALB/c小鼠分為3組,分別肌肉注射rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP或PBS。3周后殺死動(dòng)物,取脾細(xì)胞,分別以LMP2特異性表位肽或非特異性肽干預(yù),培養(yǎng)4天后,以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖。
結(jié)果:1. 經(jīng)過(guò)酶切鑒定、PCR、測(cè)序法證實(shí)重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒pAAV-LMP2/1-hsp構(gòu)建成功。2.免疫印跡法證實(shí)該病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞
7、后可表達(dá)融合蛋白。3. 先用 rAAV LMP2/1-hsp 或 rAAV GFP免疫 BALB/c小鼠,然后接種 SP2/0 或SP2/0-LMP2細(xì)胞,雖然各組都能成瘤,但是rAAV-LMP2/1-hsp組的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯比其他各組緩慢,而其他各組之間無(wú)差異。第35天,rAAV LMP2/1-hsp免疫組的腫瘤體積大約是rAAV GFP免疫組的1/5。4. 先接種 SP2/0 或SP2/0-LMP2細(xì)胞,然后用 rAAV LMP2
8、/1-hsp 或 rAAV GFP免疫 BALB/c小鼠。rAAV-GFP免疫組的小鼠腫瘤進(jìn)展迅速,在免疫的第20天全部死亡;而rAAV LMP2/1-hsp免疫組的小鼠腫瘤生長(zhǎng)緩慢,生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。5. BALB/c小鼠接種rAAV-LMP2/1-hsp,rAAV-GFP或生理鹽水,3周后殺死動(dòng)物,分離培養(yǎng)脾細(xì)胞。用SP2/0-LMP2或SP2/0細(xì)胞作為靶細(xì)胞,小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞,以LDH釋放法測(cè)定細(xì)胞毒性T細(xì)胞功能,結(jié)果顯示
9、rAAV-LMP2/1-hsp免疫組的脾細(xì)胞在LMP2表位肽的刺激下裂解SP2/0-LMP2和SP2/0細(xì)胞,而其他各組不發(fā)生裂解。6. 以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖反應(yīng),結(jié)果顯示來(lái)源于rAAV-E7CTL-hsp免疫組的小鼠T細(xì)胞在LMP2表位肽的刺激作用下發(fā)生增值,而其他組T細(xì)胞不增值。
結(jié)論:利用腺相關(guān)病毒載體成功構(gòu)建了一種鼻咽癌疫苗,以EB病毒潛伏期膜蛋白1、2的基因作為表位,并融合了熱休克蛋白作為佐劑,該疫苗可能通過(guò)
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